Μελέτη της επιδιόρθωσης βλαβών DNA από ιοντίζουσα ακτινοβολία με ανάλυση εστιών γH2AX σε εικόνες ανοσοφθορισμού - Φραγκούλης, Γεώργιος (Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Εφαρμοσμένων Μαθηματικών και Φυσικών Επιστημών. Τομέας Ανθρωπιστικών Κοινωνικών Επιστημών και Δικαίου, 2017)
Η ιοντίζουσα ακτινοβολία προκαλεί πλήθος διαφορετικών βλαβών στο DNA των κυττάρων. Οι ομαδοποιημένες βλάβες (πολλές βλάβες κοντά μεταξύ τους στην αλληλουχία του DNA) και οι δίκλωνες θραύσεις είναι πιο επικίνδυνες, γιατί οι μηχανισμοί επιδιόρθωσης δυσκολεύονται να τις επεξεργαστούν περισσότερο από τις μεμονωμένες αλλοιώσεις. Όσο πιο πυκνές είναι οι ομαδοποιημένες βλάβες τόσο πιο δύσκολα επιδιορθώνονται και μπορούν να οδηγήσουν με τη σειρά τους σε δίκλωνες θραύσεις. Οι δίκλωνες θραύσεις μπορούν να εντοπιστούν με τη φωσφορυλίωση της ιστόνης H2AX (γΗ2ΑΧ), η οποία εμφανίζεται γρήγορα σε μία μεγάλη περιοχή της χρωματίνης μετά από δίκλωνη θραύση γύρω από τη βλάβη και είναι βασική για την αποτελεσματικότητα της επιδιόρθωσης. Όταν η δίκλωνη θραύση επιδιορθωθεί αποφωσφορυλιώνονται σταδιακά. Οι περιοχές αυτές μπορούν να οπτικοποιηθούν μέσω της μικροσκοπίας ανοσοφθορισμού ώστε να εκτιμηθεί ο αριθμός των δίκλωνων θραύσεων. Ονομάζονται εστίες γΗ2ΑΧ και για μεγάλο εύρος δόσεων ο αριθμός τους ισούται με τον αριθμό των δίκλωνων θραύσεων στον πυρήνα. Η επαγωγή των εστιών γΗ2ΑΧ και η εξέλιξή τους αντικατοπτρίζουν την επαγωγή δίκλωνων θραύσεων και την επιδιόρθωσή τους. Στο πλαίσιο της εργασίας γίνεται μία εισαγωγή στην απόκριση του κυττάρου στην βλάβη DNA και τον ρόλο της γΗ2ΑΧ σε αυτήν και ως βιοδείκτη. Ακόμη μελετήθηκε η επιδιόρθωση των δίκλωνων θραύσεων σε λεμφοκύτταρα για δόσεις 1Gy και 2Gy ακτίνων-γ (60Co) μέσα από ανάλυση εικόνων ανοσοφθορισμού με το λογισμικό JCount. Σκοπός ήταν, αρχικά, να μετρηθούν οι διαφορές στην επαγωγή εστιών γΗ2ΑΧ μεταξύ ακτινοβολημένων και μη κυττάρων σε διαφορετικούς χρόνους μετά την ακτινοβόληση. Παρατηρήθηκε επαναφορά του αριθμού των εστιών στα επίπεδα ελέγχου μετά τις 6 ώρες, ενώ νωρίτερα οι δύο δόσεις μπορούν να διακριθούν. Ακόμη δοκιμάστηκαν δύο μέθοδοι στατιστικής ανάλυσης σε ήδη υπάρχοντα δεδομένα για τον προσδιορισμό του αριθμού των εστιών γΗ2ΑΧ σε σχέση με τη φάση του κυτταρικού κύκλου σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα μαστού MCF7 (ακτίνες-γ) και αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα A549 (ακτίνες-Χ). Η μία μέθοδος δοκιμάζει την προσαρμογή 4 διαφορετικών κατανομών με δύο κορυφές στο ιστόγραμμα συχνοτήτων των εστιών γΗ2ΑΧ ανά κύτταρο για να βρεθεί η μέση τιμή τους στις φάσεις G0/G1 (πρώτη κορυφή) και G2 (δεύτερη κορυφή). Προτείνονται κριτήρια για την επιλογή των κατάλληλων κατανομών και χρησιμοποιούνται. Για τα MCF7 προκύπτει σχέση ανάμεσα στον αριθμό εστιών και τη δόση #OfFoci=16,77D+0,52. Η δεύτερη μέθοδος χρησιμοποιεί κατανομή με δύο κορυφές στο ιστόγραμμα της συνολικής έντασης στο DAPI για τον εντοπισμό κυττάρων που βρίσκονται σε αυτές τις φάσεις. Προτείνονται κριτήρια για την επιλογή των πυρήνων βάσει της ένταση στο DAPI στα κύτταρα Α549 και ακολουθεί η στατιστική ανάλυση σε αυτό τον πληθυσμό. Τα ακτινοβολημένα διακρίνονται από τα μη ακτινοβολημένα με τη χρήση της Poisson και με την απλή στατιστική ανάλυση για χρόνους μικρότερους από 8 ώρες.