Μελέτη της βιοτεχνολογικής αξιοποίησης και βιοκαταλυτικής συμπεριφοράς του μικροφύκους Nannochloropsis oceanica - Σαββίδου, Μαρία-Θεογνωσία Γ. (Σχολή Χημικών Μηχανικών, 2017)
Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής μελετήθηκε η βιοτεχνολογική αξιοποίηση και η βιοκαταλυτική συμπεριφορά του μικροφύκους Nannochloropsis oceanica CCMP1779. Το μικροφύκος N. oceanica CCMP1779, θεωρείται από τα σημαντικότερα λόγω της χρήσης του στην παραγωγή βιοκαυσίμων, προϊόντων φαρμακευτικού και διατροφικού ενδιαφέροντος καθώς και ως πρόσθετο σε ζωοτροφές και καλλυντικά. Εξετάσθηκε ο ρόλος της αρχικής τιμής του pH της καλλιέργειας (7.4 έως 9.0), της φωτοπεριόδου (24h φως, 16:8h φως:σκότος και 24h σκότος), της σύστασης του θρεπτικού μέσου καλλιέργειας (απομάκρυνση ιόντων Fe3+, Mn2+, ΝO31- και PO3-), της συγκέντρωσης του όξινου ανθρακικού νατρίου (NaHCO3) (0.5 έως 5.0 g L-1) και του νιτρικού νατρίου (NaNO3) (0.0 έως 0.1125 g L-1) καθώς και της συνδυασμένης επίδρασης αυτών, στη παραγωγή βιομάζας και λιπιδίων και στη βιοσύνθεση της χλωροφύλλης και των επιμέρους λιπαρών οξέων. H παραγωγή της βιομάζας και η συσσώρευση των λιπιδίων και της χλωροφύλλης ευνοήθηκαν όταν το μικροφύκος N. oceanica CCMP1779 καλλιεργήθηκε σε θρεπτικό μέσο με αρχική τιμή pH 8.0. Κατά την καλλιέργεια του μικροφύκους σε συνεχές φως, βρέθηκε ότι η παραγωγή βιομάζας ήταν 1.4 και 1.7 φορές μεγαλύτερη από την αντίστοιχη καλλιέργεια όπου η φωτοπερίοδος ήταν 16:8 h φως:σκότος ή συνεχές σκότος. Το μέγιστο λιπιδικό περιεχόμενο υπολογίσθηκε όταν η φωτοπερίοδος ρυθμίστηκε σε 16:8h φως:σκότος. Επιπλέον, μελετήθηκε ο ρόλος της σύστασης του μέσου καλλιέργειας του μικροφύκους N. oceanica CCMP1779 και διαπιστώθηκε ότι όταν το μικροφύκος N. oceanica CCMP1779 καλλιεργήθηκε στο θρεπτικό μέσο F/2 παρουσία όλων των απαραίτητων συστατικών και βιταμινών, επετεύχθη η υψηλότερη συγκέντρωση βιομάζας. Το λιπιδικό περιεχόμενο βρέθηκε κατά 10% αυξημένο όταν μικροοργανισμός καλλιεργήθηκε σε θρεπτικό μέσο απουσία του νιτρικού νατρίου. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσίασε η μελέτη του ρόλου της σύστασης του θρεπτικού μέσου στη συγκομιδή του μικροφύκους N. oceanica CCMP1779 με τη χρήση μαγνητικών σωματιδίων Fe3O4. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υψηλότερη απόδοση συγκομιδής της βιομάζας επετεύχθη όταν εξαιρέθηκε από την καλλιέργεια η κύρια πηγή φωσφόρου (NaH2PO4), ενώ παράλληλα η ίδια συνθήκη οδήγησε σε παραγωγή βιομάζας της τάξης του 92% σε σχέση με τη βιομάζα που προέκυψε όταν ο μικροοργανισμός καλλιεργήθηκε σε πλήρες θρεπτικό μέσο. Όταν ο μικροοργανισμός N. oceanica CCMP1779 καλλιεργήθηκε υπό αυξανόμενες αρχικές συγκεντρώσεις όξινου ανθρακικού νατρίου (NaHCO3) (0.5 έως 5.0 g L-1) και σταθερή αρχική συγκέντρωση νιτρικού νατρίου, παρατηρήθηκε ότι ο τετραπλασιασμός της συγκέντρωσης του NaHCO3 (από 0.5 g L‐1 στα 2.0 g L‐1) οδήγησε σε 1.9 φορές μεγαλύτερη συσσώρευση βιομάζας, ενώ το λιπιδικό περιεχόμενο βρέθηκε ίσο με 32.2 % επί της ξηρής βιομάζας. Αντίστοιχα, ο μικροοργανισμός N. oceanica CCMP1779 καλλιεργήθηκε σε αυξανόμενες αρχικές συγκεντρώσεις νιτρικού νατρίου (NaΝO3) (0.0 έως 0.1125 g L-1) και σταθερή αρχική συγκέντρωση του όξινου ανθρακικού νατρίου. Διαπιστώθηκε ότι η αύξηση της αρχικής συγκέντρωσης NaΝO3 (από 0 σε 0.1125 g L‐1) οδήγησε σε βελτίωση της παραγωγής βιομάζας κατά 54%. Παρόλα αυτά, το λιπιδικό περιεχόμενο μειώθηκε από 41.6% έως 31.2%, με την αύξηση της συγκέντρωσης NaNO3 από 0 έως 0.1125 g L-1. Το φαινόμενο αυτό υποδηλώνει ότι η έλλειψη του αζώτου επάγει τη συσσώρευση των λιπιδίων στα κύτταρα. Στη συνέχεια, με τη μεθοδολογία της επιφανειακής απόκρισης διερευνήθηκε η συνδυασμένη επίδραση της συγκέντρωσης της πηγής άνθρακα (NaHCO3) και αζώτου (NaΝO3) στην παραγωγή βιομάζας, χλωροφύλλης, λιπιδίων και επί μέρους λιπαρών οξέων. H παραγωγή βιομάζας ευνοήθηκε όταν ο μικροοργανισμός καλλιεργήθηκε σε αρχικές συγκεντρώσεις NaHCO3 και NaΝO3 ίσες με 2.3 και 0.075 g L-1, αφού παρήχθησαν 0.58 g L‐1 βιομάζας, ενώ η υψηλότερη περιεκτικότητα σε λιπίδια (44.65%) καταγράφηκε σε χαμηλές συγκεντρώσεις της πηγής άνθρακα και αζώτου (0.189 και 0.075 g L-1 αντίστοιχα). Αναφορικά με το προφίλ των λιπαρών οξέων (FAS) του μικροφύκους Ν. oceanica CCMP1779 βρέθηκε ότι κυριαρχείται από κορεσμένα (SFAs) και μονοακόρεστα λιπαρά οξέα (MUFAs), τα οποία αποτελούν το 88-95% των συνολικών λιπαρών οξέων, ενώ τα πολυακόρεστα λιπαρά (PUFAs) αντιπροσωπεύουν το 5-11%. Η βελτιστοποίηση που προέκυψε βασιζόμενη στο κεντρικό πειραματικό σχεδιασμό έδειξε ότι ο συνδυασμός των 1.3 g L-1 NaHCO3 και 0.06 g L-1 NaNO3 μεγιστοποιεί τη συσσώρευση των λιπαρών οξέων και το περιεχόμενο σε MUFAs, ενώ οδηγεί στην ελάχιστη περιεκτικότητα σε PUFAs και εικοσαπενταενοϊκό οξύ (EPA). Ακολούθησε κλιμάκωση μεγέθους με τη καλλιέργεια του N. oceanica CCMP1779 σε φωτοβιοαντιδραστήρα όγκου 5L όπου η παραγωγή ξηρής βιομάζας βρέθηκε ίση με 1.47 g L-1 . Εξαιτίας της πληθώρας των βιοτεχνολογικών εφαρμογών της ενζυμικής κατάλυσης, η ανάγκη εύρεσης νέων ενζυμικών δράσεων από μικροοργανισμούς κρίνεται απαραίτητη. Έτσι, στα πειραματικά αποτελέσματα συγκαταλέγεται η δυνατότητα αξιοποίησης του μικροοργανισμού σε αντιδράσεις βιοκατάλυσης με την μορφή ολοκλήρων κυττάρων ή κυτταρικών μεμβρανών (αντιδράσεις υδρόλυσης και εστεροποίησης) του μικροφύκους N. oceanica CCMP1779. Αρχικά, προσδιορίστηκε η τοπολογία των ενζυμικών δράσεων. Λιπολυτική δράση προσδιορίστηκε στα ολόκληρα κύτταρα και στις κυτταρικές μεμβράνες του μικροοργανισμού ενώ δεν ανιχνεύτηκε εξωκυτταρικά. Η μέγιστη δραστικότητα του λιπολυτικού ενζύμου εντοπίστηκε στις κυτταρικές μεμβράνες (CDLA) του μικροοργανισμού. Η βέλτιστη θερμοκρασία δράσης του CDLA βρέθηκε ίση με 50 oC. Όσον αφορά στη τιμή του pH, το CDLA εμφανίστηκε αρκετά σταθερό σε ένα ευρύ φάσμα τιμών και ως βέλτιστη τιμή δράσης ήταν η τιμή 7.0. Επίσης, επέδειξε σταθερότητα παρουσία διαφορετικών οργανικών διαλυτών ενώ διατήρησε υψηλότερη δραστικότητα σε μη-πολικούς διαλύτες και συγκεκριμένα το n-οκτάνιο (71%) μετά από 6 ώρες επώασης. Η επίδραση διαφόρων μεταλλικών ιόντων όπως του μαγγανίου (Mn2+) ενίσχυσε την δραστικότητα κατά 68.25%. Όταν εξετάσθηκε η επίδραση επιφανειοδραστικών ουσιών, προέκυψε ότι η παρουσία της αμφιτεριονικής (CHAPS) και της μη-ιονικής επιφανειοδραστικής ουσίας (Triton Χ-100) παρεμπόδισε τη λιπολυτική δράση του προσδεμένου στη μεμβράνη ενζύμου και παράλληλα δεν κατέστη δυνατή η αποδέσμευσή του από την κυτταρική μεμβράνη. Ολοκληρώνοντας τον χαρακτηρισμό του CDLA, μελετήθηκε η υδρολυτική εξειδίκευση του έναντι εστέρων της παρα-νιτροφαινόλης με λιπαρά οξέα διαφορετικού μήκους ανθρακικής αλυσίδας (C2:0-C16:0) και βρέθηκε η προτίμηση του στον εστέρα της παρα – νιτρο – φαινόλης με παλμιτικό οξύ. Η μέγιστη ταχύτητα της αντίδρασης (vmax) ήταν ίση με 0.138, 0.257 και 0.054 mmole pNP/mg protein/min, αντίστοιχα για τους τρεις εστέρες (pNPC, pNPL, pNPP) και η σταθερά Michaelis-Menten (Km) ίση με 0.352, 0.874 και 0.051 mM. Οι σταθερές παρεμπόδισης (KI) για τους εστέρες της παρα – νιτρο – φαινόλης με λαυρικό και παλμιτικό οξύ βρέθηκαν ίσες με 0.185 και 0.898 mM, αντίστοιχα. Ο προσδιορισμός της λιπολυτικής ικανότητας των ολόκληρων κύτταρων μέσω της αντίδρασης υδρόλυσης σε θερμοκρασία 30οC, έδειξε ότι το ενζυμικό σκεύασμα παρουσίασε μεγαλύτερη εξειδίκευση σε υποστρώματα με μικρού μήκους ανθρακική αλυσίδα (εστέρας της παρα – νιτρο – φαινόλης με βουτυρικό οξύ) και η βελτιστη τιμή δράσης ήταν το pH 7.0. Επίσης εμφάνισε θερμοσταθερότητα σε υψηλές θερμοκρασίες ενώ η κατεργασία του με επιφανειοδραστικές ουσίες (SDS, Triton X-100, CHAPS) προκάλεσε απώλεια της ενζυμικής δραστικότητας. Ακολούθως βρέθηκε ότι η παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων NaCl οδήγησε σε μείωση της λιπολυτικής δράσης κατά 50%. Τέλος, μελετήθηκε η δυνατότητα αξιοποίησης του μικροοργανισμού σε αντιδράσεις εστεροποίησης λιπαρών οξέων με πρωτοταγείς αλκοόλες καταλυόμενες από το CDLA. Μελετήθηκε η συγκέντρωση του ενζυμικού σκευάσματος, η ταχύτητα ανάδευσης της αντίδρασης, η επίδραση της θερμοκρασίας στην αντίδραση καθώς και η επίδραση του μήκους της ανθρακικής αλυσίδας των πρωτοταγών αλκοολών (μεθανόλη, αιθανόλη, n-προπανόλη και n-βουτανόλη). Η αντίδραση εστεροποίησης του παλμιτικού οξέος με την αιθανόλη σε η-οκτάνιο καταλυόμενη από το CDLA φάνηκε να ακολουθεί μηχανισμό πινγκ-πονγκ, χωρίς αναστολή από το υπόστρωμα (εντός της συγκεκριμένης περιοχής συγκεντρώσεων υποστρωμάτων που εξετάσθηκαν). Οι κινητικές σταθερές της αντίδρασης εστεροποίησης βρέθηκαν ίσες με vmax=7.02•10-4 mmol εστέρα/g Ε.Σ./h, Κm,παλμιτικού οξέος=86.96 mM και Κm,αιθανόλης=341.71 mM. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ιδιότητες του προς μελέτη ενζυμικού συστήματος το οποίο βρίσκεται ακινητοποιημένο στις κυτταρικές μεμβράνες, το καθιστούν ένα ενδιαφέρον σύστημα για περαιτέρω διερεύνηση, ενώ για πρώτη φορά πραγματοποιήθηκε μια επιτυχημένη προσπάθεια μελέτης των ενζυμικών δράσεων του μικροφύκους N. oceanica CCMP1779.