Παραγωγή και χαρακτηρισμός μιας καινοτόμου λακκάσης από το θερμόφιλο ασκομύκητα Myceliophthora thermophilα - Κουτρουφίνη, Ευθυμία (Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV), 2017)
Περίληψη Οι λακκάσες (βενζενεδιόλη: οξειδοαναγωγάση οξυγόνου, EC 1.10.3.2) ανήκουν στην ευρύτερη κατηγορία των οξειδωτικών ενζύμων που φέρουν πολλαπλούς χαλκούς στο ενεργό τους κέντρο και χρησιμοποιούνται σε πλήθος βιοτεχνολογικών εφαρμογών. Το ενδιαφέρον για τις λακκάσες αυξάνεται διαρκώς λόγω των πλεονεκτημάτων που εμφανίζουν ως βιοκαταλύτες και επικεντρώνεται στην έκφραση νέων λακκασών από τις καλύτερες δυνατές πηγές, τη διερεύνηση της δομής, των ιδιοτήτων και του μηχανισμού δράσης τους. Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η παραγωγή και ο χαρακτηρισμός μιας καινοτόμου λακκάσης (MtLac2) από το θερμόφιλο μύκητα Myceliophthora thermophila. Αρχικά εξετάστηκε η επίδραση φυσικοχημικών παραγόντων κατά την ετερόλογη παραγωγή της MtLac2 από το μεθυλότροφο ζυμομύκητα P. pastoris και προσδιορίστηκε η συγκέντρωση μεθανόλης (1% v/v) και χαλκού (0,025 mM) όπου επιτυγχάνεται μέγιστη παραγωγή λακκάσης. Η βελτιστοποίηση ως προς τη συγκέντρωση χαλκού αύξησε την παραγωγή του ενζύμου κατά 125% ενώ ως προς τη συγκέντρωση μεθανόλης 35,5%. Επίσης προσδιορίστηκε η βέλτιστη θερμοκρασία επώασης της καλλιέργειας (30 οC). Στη συνέχεια, η MtLac2 απομονώθηκε με σκοπό το βιοχημικό χαρακτηρισμό της. Αρχικά προσδιορίστηκε πειραματικά το μοριακό βάρος (80 και 110kDa) και το ισοηλεκτρικό σημείο (pI=4) του ενζύμου. Με επεξεργασία των πειραματικών αποτελεσμάτων και βιοπληροφορικών δεδομένων, η έκφραση του ενζύμου ως δυο πρωτεϊνικά μόρια αποδόθηκε σε διαφορετικά πρότυπα Ο-γλυκοζυλίωσης. Στη συνέχεια, μελετήθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες δράσης της MtLac2 καθώς και η σταθερότητα του ενζύμου στις διακυμάνσεις του pH και της θερμοκρασίας. Η δραστικότητα του ενζύμου είναι υψηλή στην περιοχή pH 3-4.5, ενώ σε βασικές και ουδέτερες τιμές pH μηδενίζεται. Το ένζυμο παρουσίασε υψηλή ενεργότητα στους 50 οC όπου ο χρόνος ημιζωής του είναι μεγαλύτερος από 24 ώρες, επομένως μπορεί να χαρακτηριστεί ως θερμόφιλο. Κατά τη μελέτη της δράσης του ενζύμου παρουσία οργανικών διαλυτών και παρεμποδιστών, η MtLac2 παρουσίασε ικανοποιητική ανθεκτικότητα σε όλες τις ενώσεις που δοκιμάστηκαν, ενώ το αζίδιο του νατρίου φάνηκε να επιφέρει την ισχυρότερη παρεμπόδιση. Ο χαρακτηρισμός του ενζύμου ολοκληρώθηκε με τη μελέτη εξειδικευμένης δράσης του σε μεγάλο εύρος φαινολικών υποστρωμάτων, το ABTS και το ασκορβικό οξύ, καθώς και με μελέτη της κινητικής της MtLac2 στα υποστρώματα ABTS και 2,6-DMP. Από τα αποτελέσματα φαίνεται ότι η MtLac2 έχει πιθανότατα χαμηλό οξειδοαναγωγικό δυναμικό καθώς δεν εμφανίζει πολύ υψηλή ενεργότητα στα μελετούμενα υποστρώματα. Ακόμη, το ένζυμο συνολικά παρουσίασε πολύ διαφορετικά καταλυτικά χαρακτηριστικά σε σχέση με τις περισσότερες χαρακτηρισμένες λακκάσες κυρίως λόγω της υψηλής ενεργότητας που έδειξε στο ασκορβικό οξύ. Στο τελευταίο μέρος της εργασίας η MtLac2 αξιολογήθηκε βιοτεχνολογικά σε διάφορες εφαρμογές βιομηχανικού ενδιαφέροντος. Η καινοτόμος λακκάση χρησιμοποιήθηκε στη δοκιμή αποτοξικοποίησης απόβλητου ελαιουργείου (ΥΑΕ), στην ενζυμική τροποποίηση εμπορικής γλυκάνης και στη βιοσύνθεση σουλφουρετίνης από βουτεΐνη. Από τις τρείς εφαρμογές η λακκάση έδρασε βέλτιστα στην οργανική σύνθεση, η οποία κρίθηκε επιτυχής, ενώ στην περίπτωση της ενζυμικής τροποποίησης παρουσίασε μια ένδειξη μεταβολής της δομής της γλυκάνης η οποία πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω. Τέλος, στην περίπτωση της αποτοξικοποίησης υγρού αποβλήτου ελαιουργείου, η λακκάση δεν φάνηκε να αποικοδομεί το απόβλητο.