Ηλεκτροχημική μελέτη της υπεροξειδάσης MtPerII & διερεύνηση δυνατότητας εφαρμογής της σε βιοαισθητήρα - Ζουράρης, Δημήτριος (Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Επιστήμης και Τεχνικής των Υλικών (ΙΙΙ). Εργαστήριο Φυσικοχημείας, 2017)
Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας αποτελεί η ηλεκτροχημική μελέτη της υπεροξειδάσης MtPerII με σκοπό την εύρευση των κινητικών της σταθερών και ο προσδιορισμός του προτύπου δυναμικού της με τη μέθοδο της κυκλικής βολταμμετρίας καθώς και η ακινητοποίηση του ενζύμου σε ηλεκτροδίο χρυσού μέσω θειολών με σκοπό τη διερεύνηση δυνατότητας αξιοποίησης της σε βιοαισθητήρα. Αρχικά, υποθέτωντας μηχανισμό ping pong για τη δράση του ενζύμου με το υπεροξείδιο και το συνυπόστρωμα, και αγνοώντας την όποια απενεργοποίηση του ενζύμου, με χρήση της μεθόδου της κυκλικής βολταμμετρίας με μεταβολή της ταχύτητας σάρωσης, κατ’ αρχάς για συγκέντρωση συνυποστρώματος κυανού του μεθυλενίου 62.5μΜ και συγκέντρωση υπεροξειδίου του υδρογόνου 80mM, υπολογίζεται η σταθερά 𝑘2,2 = 9.4 ×107 M−1s−7, και κατόπιν για συγκέντρωση κυανού του μεθυλενίου 62.5 μM και συγκεντρώσεις του υπεροξειδίου του υδρογόνου 17.5, 34.3, 86.5, 141 mM υπολογίστηκαν οι υπόλοιπες κινητικές σταθερές 𝑘1 = 1258M−1s−1, 𝑘1,2 = 110.4 s−1, 𝐾1,M = 0.088M, 𝑘1,1 = 2401 M−1s−1, 𝑘1,−1 = 101 s−1. Εν συνεχεία, με τη μέθοδο των πεπερασμένων στοιχείων, με τη χρήση των σταθερών που εξήχθησαν από την πειραματική διαδικασία έγινε επίλυση της ηλε- κτροαναλυτικής μορφής της εξίσωσης Butler - Volmer για υπολογιστική αναπαραγωγή των πειραματικών κυκλικών βολταμμογραφημάτων και εν τέλει σύγκριση των πειραματικών δεδομένων με τα υπολογιστικά. Επίσης, έγινε πρόβλεψη της μορφής των κυκλικών βολταμμογραφημάτων για ταχύτητες σάρωσης μικρότερες των 5 mV/s, οι οποίες λόγω περιορισμών του συστήματος δεν ήταν δυνατό να επιτευχθούν πειραματικά. Με τη χρήση πυρολυτικού άνθρακα ως ηλεκτρόδιο εργασίας πραγματοποιήθηκε κυκλική βολταμμετρία για τον προσδιορισμό του φαινόμενου πρότυπου δυναμικού Ε′∘ του ενζύμου για το οξειδοαναγωγικό ζεύγος Fe(III)/Fe(II), το οποίο για pH=8 υπολογίστηκε περίπου -0.265mV vs SCE. Έγινε προσδιορισμός του Ε′∘ και μέσω ακινητοποίησης του ενζύμου σε ηλεκτρόδιο ελάσματος χρυσού τροποποιημένο με πεντανοθειόλη σε ένα εύρος pH 4-8 και βρέθηκε η γραμμική εξάρτηση Ε′∘ =0.0582pH + 0.3472. Κατόπιν εξετάστηκε η τροποποίηση ηλεκτροδίου ελάσματος χρυσού με εμβάπτιση σε αιθανολικό διάλυμα δωδεκανοθειόλης 0.1mM με σκοπό την μετέπειτα προσρόφηση ενζύμου σε αυτό και τη διερεύνηση δυνατότητας εφαρμογής ως βιοαισθητήρα υπεροξειδίου. Αρχικά έγινε καθαρισμός του ηλεκτροδίου χρυσού με κυκλική πόλωση σε υδατικό διάλυμα θειικού οξέος 1 Μ και κατόπιν υπολογισμός της ηλεκτροχημικώς ενεργής επιφάνειας του χρυσού με χρήση κυκλικής βολταμμετρίας και τη χρήση σιδηροκυανιούχων ιόντων με φέροντα ηλεκτρολύτη θειικό νάτριο. Η επιφάνεια εκτιμήθηκε 0.217 cm2. Έπειτα επιβεβαιώθηκε η κάλυψη του χρυσού από τη δωδεκανοθειόλη με φασματομετρία ηλεκτροχημικής εμπέδισης και κυκλική βολταμμετρία με χρήση σιδηροκυανιούχων ιόντων με φέροντα ηλεκτρολύτη θειικό νάτριο. Η κάλυψη μετά από 420 min υπολογίστηκε περίπου 72%. Επίσης μέσω της ηλεκτροχημικής εκρόφησης με τη μέθοδο της γραμμικής βολταμμετρίας σάρω- σης υπολογίστηκε η επιφανειακή συγκέντρωση του ενζύμου στην επιφάνεια του 1 χρυσού ίση με 5.8 ×10−10 mol/cm2 Στη συνέχεια, έγινε εμβάπτιση του τροποποιημένου με δωδεκανοθειόλη ηλεκτροδίου ελάσματος χρυσού σε ενζυμικό διάλυμα MtPerII και η επιβεβαίωση προσρόφησης του ενζύμου πραγματοποιήθηκε ηλεκτροχημικά με γραμμική βολταμμετρία σάρωσης και φασματομετρικά με ATR, ενώ η διαπίστωση ενεργότητας του ακινητοποιημένου ενζύμου με δοκιμή με ABTS. Eπίσης με UV-Vis έγινε εκτίμηση της επιφανειακής συγκέντρωσης του ενζύμο στο ηλεκτρόδιο 3 ×10−10 mol/cm2. Όσον αφορά στην ανάπτυξη του βιοαισθητήρα, το τροποποιημένο ηλεκτρόδιο δοκιμάστηκε με δύο συνυποστρώματα και προέκυψε ότι για τη χρήση κυανού του μεθυλενίου οι βέλτιστες συνθήκες λειτουγίας βρέθηκαν pH=8, δυναμικό -300mV vs SCE, συγκέντρωση συνυποστρώματος 1 mM, υπό ανάδευση στις 200 στροφές ανά λεπτό, όριο ανίχνευσης για λόγο σήματος/θορύβου 2, 0.023 mM, όριο ποσοτικοποίησης 0.115 mM, μεγάλη σταθερότητα μέχρι τις 16 χρήσεις και μέγιστος χρόνος απόκρισης 5 s. Σχετικά με τη χρήση της κατεχόλης ως συνυπόστρωμα οι βέλτιστες συνθήκες λειτουγίας βρέθηκαν pH=7, δυναμικό -200mV vs SCE, συγκέντρωση συνυποστρώματος 1 mM, υπό ανάδευση στις 200 στροφές ανά λεπτό, όριο ανίχνευσης για λόγο σήματος/θορύβου 2, 0.033 mM, όριο ποσοτικοποίη- σης 0.163 mM, μεγάλη σταθερότητα μέχρι τις 15 χρήσεις και μέγιστος χρόνος απόκρισης 8 s. Εν τέλει, έγινε σύγκριση με τους βιοαισθητήρες υπεροξειδίου της βιβλιογραφίας που βασίζονται στην ακινητοποίηση της υπεροξειδάσης horse radish peroxidase.