Επιδιόρθωση οξειδωτικών ομαδοποιημένων βλαβών DNA ύστερα από έκθεση καρκινικών κυττάρων σε ιοντίζουσες ακτινοβολίες - Νικητάκη, Ζαχαρένια (Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Εφαρμοσμένων Μαθηματικών και Φυσικών Επιστημών. Τομέας Φυσικής. Εργαστήριο Βλαβών DNA, 2017)
Στη διατριβή αυτή μελετήθηκαν οι σύνθετες οξειδωτικές βλάβες DNA, δίκλωνες θραύσεις αυξημένης πολυπλοκότητας που συνοδεύονται και από βλάβες βάσεων στην εγγύς τους περιοχή. Οι βλάβες αυτές θεωρούνται η υπογραφή των ιοντιζουσών ακτινοβολιών αλλά και του ισχυρού οξειδωτικού στρες στο κύτταρο. Αποτελούνται από διάφορες βλάβες, όπως δίκλωνες θραύσεις, μονόκλωνες και αλλοιώσεις βάσεων πολύ κοντά η μία στην άλλη εντός 10-15 ζευγών βάσεων DNA. Λόγω της μεγάλης δυσκολίας επιδιόρθωσής τους μπορούν να οδηγήσουν πολύ εύκολα σε μεταλλάξεις, γονιδιωματική αστάθεια και καρκινογένεση. Επιπλέον, στη διεθνή βιβλιογραφία είναι γενικά αποδεκτό ότι υπάρχει μεγάλη δυσκολία να ανιχνευθούν σε επίπεδο κυττάρου in situ. Η μέθοδος που κύρια ακολουθήθηκε είναι ο in situ έμμεσος ανοσοφθορισμός σε πειραματικό επίπεδο με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων έναντι των διάφορων πρωτεϊνών που συμμετέχουν στην επιδιόρθωση των επιμέρους βλαβών π.χ. δίκλωνων (γ-Η2ΑΧ), οξειδωτικών (OGG1) κτλ. Επίσης έγινε μετα-ανάλυση παλαιότερων πειραματικών δεδομένων, κάνοντας εφικτή τη συστηματική θεώρηση των φαινομένων με εργαλεία Βιοπληροφορικής. Το ενδιαφέρον για τις βλάβες στο DNA αλλά και την απόκριση του κυττάρου σε αυτές προκύπτει από τη διττή δράση των ιοντιζουσών ακτινοβολιών. Αφενός, η τυχαία έκθεση σε ιοντίζουσες ακτινοβολίες μπορεί να διαταράξει την ακεραιότητα του DNA και του γονιδιώματος, προκαλώντας μεταλλάξεις, οι οποίες είτε είναι χρήσιμες, προάγοντας την εξελικτική διαδικασία, είτε είναι επιζήμιες προκαλώντας γονιδιωματική αστάθεια και πιθανά καρκίνο. Αφετέρου, μία από τις σημαντικότερες θεραπείες ενάντια στον καρκίνο, η ακτινοθεραπεία, χρησιμοποιεί τις ιοντίζουσες ακτινοβολίες για να στοχεύσει στο DNA των καρκινικών κυττάρων και να προκαλέσει την ελεγχόμενη θανάτωσή τους. Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής, μελετήθηκαν διάφορες ανθρώπινες καρκινικές σειρές προερχόμενες από καρκίνο του μαστού (MCF7), ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HepG2), καρκίνωμα του πνεύμονα (Α549), γλοιοβλάστωμα (ΜΟ59Κ και τα ισογονιδιακά τους MO59J), αλλά και φυσιολογικά αθανατοποιημένα κερατινοκύτταρα (FEP18-11-T1), καθώς και λεμφοκύτταρα υγιών δοτών. Δοκιμάστηκαν διαφορετικά είδη ιοντίζουσας ακτινοβολίας, ηλεκτρομαγνητική (ακτίνες –γ και –Χ), αλλά και φορτισμένα σωματίδια (σωμάτια –α και ιόντα Αργού). Παρατηρήθηκε αύξηση της πολυπλοκότητας των βλαβών με την αύξηση της γραμμικής μεταφοράς ενέργειας της προσπίπτουσας ακτινοβολίας, αλλά και καθυστέρηση στην επιδιόρθωση των βλαβών. Δοκιμάστηκε επίσης χημική αναστολή της επιδιορθωτικής πρωτεΐνης (κινάσης) DNA-PK με δύο διαφορετικούς αναστολείς, τους NU7026 και NU7441. Διαπιστώθηκε ότι ο NU7441 προκαλεί ισχυρότερη παρεμπόδιση της επιδιόρθωσης των δίκλωνων θραύσεων έναντι του NU7026. Επίσης η DNA-PK ελέγχθηκε και με τη χρήση ζεύγους κυτταρικών σειρών, τα ΜΟ59Κ και ΜΟ59J, όπου τα δεύτερα είναι ανεπαρκή στην έκφραση της καταλυτικής υπομονάδας της πρωτεΐνης DNA-PK. Η επιδιόρθωση φάνηκε ότι καθυστερεί μεν, αλλά εν τέλει συντελείται. Για την ανίχνευση των σύνθετων βλαβών που περιλαμβάνουν και οξειδωτικές βλάβες βάσεων στην περιοχή της δίκλωνης θραύσης DNA προσδιορίστηκε μετά από αλλεπάλληλες δοκιμές το κατάλληλο πρωτόκολλο που κάνει εφικτή την οπτικοποίησή τους, ως συνεντοπισμένο σήμα φθορισμού προερχόμενο από τα φθορίζοντα αντισώματα που στοχεύουν τις πρωτεΐνες επιδιόρθωσης των δίκλωνων θραύσεων (γ-Η2ΑΧ ή 53ΒP1) και τις πρωτεΐνες επιδιόρθωσης των βλαβών βάσεων (OGG1 ή APE1). Για την εκτίμηση του συνεντοπισμού σε εικόνες φθορισμού, προτείνεται ως αποτέλεσμα αυτής της μελέτης ένα κριτήριο-παράμετρος, το οποίο ονομάσαμε Pclc, το οποίο διατηρεί την τοπολογία των εστιών φθορισμού για τις δίκλωνες θραύσεις, που είναι και το κέντρο της επιδιόρθωσης, αλλά για τις οξειδωτικές βλάβες βάσεων λαμβάνει υπόψη τη μέση φωτεινότητά τους. Η παράμετρος Pclc συγκρίνει την επιφανειακή (χωρική) φωτεινότητα του σήματος από την επισημασμένη πρωτεΐνη επιδιόρθωσης των βλαβών βάσεων ορισμένη στις εστίες φθορισμού των δίκλωνων θραύσεων με το ίδιο μέγεθος ορισμένο στον υπόλοιπο πυρήνα του κυττάρου. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται κανονικοποίηση των όποιων διαφορών μεταξύ των πειραμάτων και παράγονται συγκρίσιμα αποτελέσματα. Το κύριο πλεονέκτημα αυτής της θεώρησης είναι ότι αποφαίνεται άμεσα για το αν ο εμφανιζόμενος συνεντοπισμός είναι τυχαίος ή βιολογικά σημαντικός, αν η τιμή είναι γύρω στο 1 ή μεγαλύτερη από το 1 αντίστοιχα. Προσεγγίζοντας το πρόβλημα της επιδιόρθωσης των σύνθετων βλαβών DNA σε επίπεδο οργανισμού και βιολογίας συστημάτων (systems biology), εκτελέσθηκε και ανάλυση των παγκόσμιων βιβλιογραφικών δεδομένων με εργαλεία βιοπληροφορικής. Έγινε χρήση πλήθους διαφορετικών εργαλείων ελεύθερου λογισμικού και πολλαπλός συστηματικός έλεγχος των αποτελεσμάτων από αναγνωρισμένες βάσεις δεδομένων. Κατά περίπτωση δόθηκε προσοχή στην κατάλληλη ονοματολογία των γονιδίων, ανάλογα με τις απαιτήσεις του κάθε ερωτήματος. Κύριο άξονα αναζήτησης αποτέλεσαν οι όροι γονιδιακής οντολογίας, ώστε να εξασφαλιστεί η αξιοπιστία των αποτελεσμάτων. Η ανάλυση χαρακτηρίζεται πρωτογενής, καθώς αναζητήθηκαν δεδομένα που είναι πειραματικώς επιβεβαιωμένα και όχι μέσω άλλων κριτηρίων (όπως τη γειτνίαση στο χρωμόσωμα ή τη συνέκφραση). Από τη βιοπληροφορική ανάλυση προέκυψε πλήθος γονιδίων για τον άνθρωπο αλλά και για τα φυτά τα οποία προτείνονται ως πιθανά να συμμετέχουν στους μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA ύστερα από έκθεση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία ιδιαίτερα των σύνθετων βλαβών. Προσδιορίστηκαν επίσης γονίδια που προτείνονται ως βιοδείκτες για την ανίχνευση στα διάφορα είδη ενδογενούς (αντιγραφής DNA, οξειδωτικού) και εξωγενούς στρες (ιοντίζουσα ακτινοβολία) αλλά και γονίδια κατάλληλα για βιολογική δοσιμετρία. Σχετικά με την ακτινοθεραπεία του καρκίνου, μελετήθηκε η συμμετοχή των γονιδίων επιδιόρθωσης και προσδιορίστηκαν γονίδια τα οποία προτείνονται ως πιθανοί στόχοι χημικής/φαρμακευτικής αναστολής για την ενίσχυση της ακτινοθεραπείας στα πλαίσια της Συνδυαστικής Φονικότητας και προτάθηκε η ιδέα της Πολλαπλής Φονικότητας. Τέλος μελετήθηκε η μη-στοχευμένη δράση της ιοντίζουσας ακτινοβολίας, δηλαδή οι αποκρίσεις που συμβαίνουν σε όλη την έκταση του οργανισμού που δέχεται την ακτινοβόληση, καθώς και η συμμετοχή των πρωτεϊνών επιδιόρθωσης του DNA σε αυτά τα φαινόμενα. Συνολικά τα αποτελέσματα της διατριβής αυτής, σχετίζονται με την επαγωγή και επιδιόρθωση των σύνθετων βλαβών DNA και οδήγησαν στη ανάπτυξη πρωτοκόλλων για την ανίχνευση των βλαβών αυτών σε επίπεδο κυττάρου in situ με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού. Η σημασία των αποτελεσμάτων κρίνεται ιδιαίτερα σημαντική και ως προς την τεχνική πρόοδο που επετεύχθη για την καλυτέρευση των μεθόδων ανίχνευσης των σύνθετων βλαβών που επάγονται από την ιοντίζουσα ακτινοβολία, αλλά και την πληροφορία για τη δυσκολία επιδιόρθωσης, κάτι που έχει και μεγάλη βιολογική σημασία.