Βιοτεχνολογική αξιοποίηση μικροβιακού και ενζυμικού συστήματος λιγνινολυτικών μυκήτων - Ζέρβα, Αναστασία (Σχολή Χημικών Μηχανικών, 2017)
Περίληψη Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση του βιοτεχνολογικού δυναμικού λιγνινολυτικών μυκήτων, τόσο σε επίπεδο ολόκληρων των οργανισμών και των καλλιεργειών τους, όσο και των επιμέρους ενζυμικών συστημάτων που είναι υπεύθυνα για την οξειδωτική διάσπαση της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας. Προς αυτή την κατεύθυνση, στα πρώτα στάδια της διατριβής δοκιμάστηκαν δυο στελέχη βασιδιομυκήτων αναφορικά με την ικανότητά τους να αποικοδομούν απόβλητα υψηλού φαινολικού φορτίου. Το απόβλητο που επιλέχθηκε προς διερεύνηση ήταν το υγρό απόβλητο ελαιουργείου (ΥΑΕ), το οποίο αποτελεί σημαντικό πρόβλημα στις χώρες παραγωγής ελαιολάδου, λόγω του υψηλού του οργανικού φορτίου και της υψηλής συγκέντρωσης φαινολικών ενώσεων. Τα στελέχη βασιδιομυκήτων Pleurotus citrinopileatus LGAM 28684 και Irpex lacteus LGAM 238 δοκιμάστηκαν ως προς την ικανότητά τους να αποικοδομούν το ΥΑΕ, ενώ διερευνήθηκε και η επίδραση διαφόρων παραμέτρων στην ικανότητα αποικοδόμησης, όπως το pH του μέσου καλλιέργειας, η προσθήκη πηγών αζώτου και η συγκέντρωσή τους. Οι συνθήκες που κρίθηκαν βέλτιστες για κάθε στέλεχος ήταν οι pH 6, 30 g L-1 εκχύλισμα επεξεργασίας σπόρων καλαμποκιού για το P. citrinopileatus και 20 g L-1 για το I. lacteus. Τα δύο στελέχη έδειξαν πολύ ικανοποιητικά επίπεδα αποικοδόμησης του ΥΑΕ και παραγωγής εξωκυτταρικών λιγνινολυτικών ενζύμων, επιτυγχάνοντας πάνω από 90% μείωση των φαινολικών ενώσεων και αποχρωματισμού. Σε επόμενο στάδιο δοκιμάστηκε η ικανότητα παραγωγής ενδοκυτταρικών και εξωκυτταρικών πολυσακχαριτών από ανάπτυξη τριών στελεχών βασιδιομυκήτων σε βυθισμένη καλλιέργεια, και επιχειρήθηκε η ταυτόχρονη αποικοδόμηση και αξιοποίηση του ΥΑΕ μέσω της παραγωγής μυκηλιακών πολυσακχαριτών. Τα στελέχη βασιδιομυκήτων που επιλέχθηκαν για αυτό το σκοπό ήταν τα Ganoderma lucidum LGAM 9720, Pleurotus citrinopileatus LGAM 28684 και Pleurotus ostreatus LGAM 1123, και αναπτύχθηκαν για συγκριτικούς σκοπούς σε δύο θρεπτικά υποστρώματα, ένα ημισυνθετικό μέσο με ξυλόζη ως πηγή άνθρακα και ένα μέσο με ΥΑΕ ως πηγή άνθρακα, ενώ δοκιμάστηκαν επίσης και δύο διαφορετικές μέθοδοι απομόνωσης των ενδοκυτταρικών πολυσακχαριτών της βιομάζας. Τα υψηλότερα επίπεδα αποικοδόμησης του ΥΑΕ παρατηρήθηκαν από το στέλεχος G. lucidum, ενώ οι εξωκυτταρικοί πολυσακχαρίτες που απομονώθηκαν από όλα τα στελέχη βρέθηκαν να είναι πιο πλούσιοι σε γλυκάνες στην περίπτωση της ανάπτυξης σε ημισυνθετικό υπόστρωμα σε σύγκριση με το θρεπτικό μέσο με ΥΑΕ. Σχετικά με τους ενδοκυτταρικούς πολυσακχαρίτες, η βιομάζα του P. ostreatus βρέθηκε να είναι η πιο πλούσια σε γλυκάνες, με ολικό περιεχόμενο 8,68 % (w/w) κατά την ανάπτυξη σε ημισυνθετικό μέσο και 7,58% (w/w) κατά την ανάπτυξη σε ΥΑΕ. Μετά την εφαρμογή των μεθόδων απομόνωσης των πολυσακχαριτών της βιομάζας, το κλάσμα με την υψηλότερη περιεκτικότητα σε γλυκάνες προήλθε από το G. lucidum μετά από ανάπτυξη σε ημισυνθετικό μέσο, με 49,1 % (w/w) ολικές γλυκάνες. Τα φάσματα FTIR των απομονωμένων κλασμάτων αποκάλυψαν την ύπαρξη α- και β- γλυκοζιδικών δεσμών, αλλά και την ύπαρξη πρωτεϊνικών επιμολύνσεων, γεγονός που υποδηλώνει ότι η απομάκρυνση των α-γλυκανών και των υπολειπόμενων πρωτεϊνών δεν επιτεύχθηκε πλήρως με καμία από τις δύο μεθόδους. Ωστόσο, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής υποδεικνύουν ότι η ταυτόχρονη αποικοδόμηση και αξιοποίηση των ΥΑΕ για παραγωγή μικροβιακών πολυσακχαριτών θα μπορούσε να είναι μια βιώσιμη λύση για την επεξεργασία τέτοιου είδους αποβλήτων. Ακολούθως, σχετικά με τη μελέτη και αξιοποίηση του ενζυμικού δυναμικού των λιγνινολυτικών μυκήτων, επιλέχθηκαν δύο γονίδια του θερμόφιλου ασκομύκητα Myceliophthora thermophila τα οποία μετά από βιοπληροφορική ανάλυση βρέθηκε ότι πιθανώς εμπλέκονται στην αποικοδόμηση της λιγνινοκυτταρίνης και άρα κρίθηκαν κατάλληλα για περαιτέρω μελέτη. Τα γονίδια αυτά απομονώθηκαν από το γονιδίωμα του μικροοργανισμού, κλωνοποιήθηκαν σε κατάλληλους φορείς και εκφράστηκαν ετερόλογα στη ζύμη Pichia pastoris. Τα ένζυμα που προέκυψαν βρέθηκε ότι είχαν ενεργότητες υπεροξειδάσης και πολυφαινολικής οξειδάσης και ονομάστηκαν αντίστοιχα MtPerII και MtLac2. Μετά την απομόνωση των ενζύμων αυτών με χρωματογραφία συγγένειας ακινητοποιημένου μετάλλου, τα καθαρά πλέον ένζυμα χαρακτηρίστηκαν πλήρως ως προς τις φυσικοχημικές, βιοχημικές και καταλυτικές ιδιότητές τους. Οι MtPerII και MtLac2 βρέθηκε ότι μπορούν να οξειδώσουν μεγάλο εύρος φαινολικών υποστρωμάτων, ενώ κρίθηκαν ιδιαίτερα θερμοσταθερά ένζυμα, αφού η μεν MtPerII φάνηκε ότι διατηρεί το 70% της ενεργότητάς της στους 50oC μετά από επώαση 8 ωρών, ενώ η MtLac2 αντίστοιχα διατηρεί το 70% της ενεργότητάς της μετά από επώαση 24 ωρών στους 50 oC. Επιπλέον, η MtPerII φάνηκε ότι διαθέτει μια ασυνήθιστα υψηλή ανθεκτικότητα σε υψηλές συγκεντρώσεις H2O2, αφού διατηρεί το 80% της αρχικής της ενεργότητας μετά από επώαση 24 ωρών σε μεγάλη περίσσεια H2O2. Σε ότι αφορά τα βιοχημικά τους χαρακτηριστικά, η μεν MtPerII δρα βέλτιστα σε συνθήκες pH 5 και 60 oC, ενώ η MtLac2 σε pH 4 και 50 oC. Εξαιτίας του υψηλού βαθμού γλυκοζυλίωσής τους, τα ένζυμα αυτά εμφανίζουν υψηλότερα μοριακά βάρη από τα θεωρητικά αναμενόμενα. Στη συνέχεια, καθένα από τα ένζυμα αυτά δοκιμάστηκε σε μια εφαρμογή που σχετίζεται με το πεδίο της βιοκατάλυσης, με ιδιαίτερη επιτυχία: Η MtPerII βρέθηκε ότι μπορεί να καταλύσει επιτυχώς τον πολυμερισμό της κατεχόλης, ενώ με τη χρήση της MtLac2 επιτεύχθηκε η βιομετατροπή φλαβονοειδών ενώσεων, από τη φυσική χαλκόνη βουτεΐνη στη φυσική ωρόνη σουλφουρετίνη, ένα προϊόν με πολλές βιολογικές δράσεις. Τέλος, η εμπορική λακκάση του M. thermophila χρησιμοποιήθηκε για τη βιομετατροπή φαινολικών ενώσεων, και συγκεκριμένα της κατεχόλης, της πυρογαλλόλης και του γαλλικού οξέος. Τα προϊόντα που προέκυψαν από την οξείδωση της κατεχόλης και του γαλλικού οξέος βρέθηκε ότι ήταν πολυμερή μόρια, τα οποίο χαρακτηρίστηκαν ως προς τις οπτικές και θερμικές ιδιότητές τους. Οι φασματοσκοπίες 1H-NMR και FTIR αποκάλυψαν ότι οι δεσμοί που δημιουργήθηκαν μεταξύ των μονομερών ήταν αιθερικοί και δεσμοί άνθρακα-άνθρακα, ενώ το μοριακό βάρος της πολυκατεχόλης βρέθηκε μεγαλύτερο από αυτό του πολύ-γαλλικού οξέος. Ωστόσο, το προϊόν βιομετατροπής της πυρογαλλόλης βρέθηκε να είναι το διμερές της, η πουρπουρογαλλίνη, ένα μόριο με πολύ υψηλή αντιοξειδωτική ικανότητα. Γενικά, η βιοκαταλυτική σύνθεση των φαινολικών πολύ- ή ολιγομερών όπως επιτεύχθηκε στην παρούσα διδακτορική διατριβή θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σαν μια εναλλακτική, πιο φιλική προς το περιβάλλον λύση σε παραδοσιακές εφαρμογές συνθετικής χημείας.