Μελέτη και βιοχημικός χαρακτηρισμός της λιπολυτικής δράσης των κυττάρων του θαλάσσιου μικροφύκους Nannochloropsis oceanica - Κατσαμπέα, Αλεξάνδρα-Σοφία (Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας, 2016)
Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν ο βιοχημικός χαρακτηρισμός της λιπολυτικής δράσης των κυτταρικών θραυσμάτων του θαλάσσιου μικροφύκους Nannochloropsis oceanica. Εξαιτίας της πληθώρας των βιοτεχνολογικών εφαρμογών της ενζυμικής κατάλυσης, η ανάγκη εύρεσης νεων ενζυμικών δράσεων από μικροοργανισμούς κρίνεται απαραίτητη. Το στέλεχος καλλιεργήθηκε σε φωτοαντιδραστήρα, όπου ο φωτισμός ήταν συνεχής και η θερμοκρασία παρέμενε σταθερή στους 20οC. Mετρήθηκε η κυτταρική ανάπτυξη του στελέχους Nannochloropsis oceanica και στη συνέχεια συλλέχθηκαν τα κύτταρα της καλλιέργειας. Ακολούθησε λύση των κυττάρων με τη χρήση της συσκευής υπερήχων και παραλαβή των κυτταρικών θραυσμάτων (debris). Στη συνέχεια υπολογίστηκε το πρωτεϊνικό περιεχόμενο του ενζυμικού σκευάσματος (θραύσματα κυττάρων επαναιωρημένα σε ρυθμιστικό διάλυμα με τιμή pH 7.0) σύμφωνα με τη μέθοδο Lowry και βρέθηκε ίση με 2.5 μg πρωτεϊνης/mg ξηρής βιομάζας. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός της λιπολυτικής ικανότητας των κυτταρικών θραυσμάτων του μικροοργανισμού μέσω αντίδρασης υδρόλυσης σε θερμοκρασία 30οC, χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα διάλυμα παρα-νίτρο-φαίνυλο λαυρικού οξέος. Ακολούθως, μελετήθηκε η θερμοσταθερότητα του ενζυμικού σκευάσματος σε θερμοκρασίες 40-90οC και βρέθηκε ότι διατηρεί το 100% της ενεργότητας του σε θερμοκρασίες έως 50οC για 1 ώρα επώασης, ενώ διατηρεί πάνω από το 80% της ενεργότητας του σε θερμοκρασίες έως 60οC για 2 ώρες επώασης. Επιπλέον, υπολογίστηκαν οι σταθερές απενεργοποίησης, η ενέργεια ενεργοποίησης της αντίδρασης υδρόλυσης (70.3 kJ/mol) και οι χρόνοι ημιζωής του ενζυμικού σκευάσματος καθώς επίσης και η μεταβολή της ενθαλπίας και εντροπίας του συστήματος. Το ενζυμικό σκεύασμα χρησιμοποιήθηκε για τη διερεύνηση της υποστρωματικής εξειδίκευσης με τη χρήση έξι διαφορετικών εστέρων της παρα-νιτροφαινόλης με λιπαρά οξέα διαφορετικού μήκους ανθρακικής αλυσίδας (C2-C16) και βρέθηκε ότι παρουσιάζει μεγαλύτερη εξειδίκευση σε υποστρώματα με μεγάλο μήκος ανθρακικής αλυσίδας. Ακολούθησε η εύρεση των κινητικών σταθερών της αντίδρασης υδρόλυσης για τρία διαφορετικά υποστρώματα (παρα-νίτρο-φαίνυλο-οκτανοϊκό οξύ, παρα-νίτρο-φαίνυλο-λαυρικό οξύ και παρα-νίτρο-φαίνυλο-παλμιτικό οξύ). Από τη μελέτη αυτή προέκυψε πως το ενζυμικό σκεύασμα εμφανίζει μεγαλύτερη συγγένεια, δηλαδή μικρότερη σταθερά Κm, με τον εστέρα με του παλμιτικού οξέος (16 άτομα άνθρακα). Όσον αφορά στο pH, το ενζυμικο σκευασμα εμφανίστηκε αρκετά σταθερο σε ένα ευρύ φάσμα τιμών και ως βελτιστη τιμή δράσης ήταν το 7.0.Το συμπέρασμα που προέκυψε ήταν ότι το ενζυμικό σκεύασμα διατηρεί πάνω από το 80% της ενζυμικής του ενεργότητας μετά από 1 ώρα επώασης σε τιμές pH 6.0-8.0, σε θερμοκρασία 30οC. Τέλος, διαπιστώθηκε η επίδραση διαφόρων οργανικών διαλυτών, μεταλλικών ιόντων και επιφανειοδραστικών ενώσεων στην ενζυμική ενεργότητα του ενζυμικού σκευάσματος. Σε ότι αφορά τους οργανικούς διαλύτες, το ενζυμικό σκεύασμα έδειξε ιδιαίτερη αντοχή μετά από επώαση 24 ωρών σε n-οκτάνιο, αιθανόλη και ακετονιτρίλο. Τα αποτελέσματα της επώασης σε μεταλλικά ιόντα επέδειξαν αύξηση της ενεργότητας του ενζυμικού σκευάσματος μετά από επώαση 1 ώρας σε MgCl2 και MnCl2, ενώ μετά από επώαση σε ZuSO4, CuSO4 και FeCl3 το ενζυμικό σκεύασμα διατήρησε λιγότερο από το 50% της αρχικής του ενεργότητας. Η επώαση σε επιφανειοδραστικές ενώσεις παρουσίασε αύξηση της ενεργότητας του ενζυμικού σκευάσματος μετά από επώαση στο SDS, ενώ για τις υπόλοιπες χρησιμοποιούμενες ενώσεις παρουσιάστηκε μείωση της ενζυμικής ενεργότητας.