ΣΤΕΡΕΩΣΗ ΠΟΡΩΔΩΝ ΔΟΜΙΚΩΝ ΛΙΘΩΝ ΙΣΤΟΡΙΚΩΝ ΜΝΗΜΕΙΩΝ ΜΕ ΒΙΟΑΠΟΘΕΣΗ ΑΝΘΡΑΚΙΚΟΥ ΑΣΒΕΣΤΙΟΥ - ΔΑΣΚΑΛΑΚΗΣ, ΜΑΡΚΟΣ (Σχολή Χημικών Μηχανικών, 2016)
Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή αποτελεί μια συστηματική προσπάθεια ανάπτυξης μεθόδου αποκατάστασης λίθινων μνημείων με τη χρήση μικροοργανισμών. Τις τελευταίες δύο δεκαετίες η έρευνα στο συγκεκριμένο τομέα έχει ενταθεί, τόσο για να βρεθούν τρόποι συντήρησης συμβατότεροι ως προς το υπόστρωμα, όσο και για να εξακριβωθεί ο ρόλος του βακτηριακού παράγοντα στη διάβρωση, αλλά και στην εκμετάλλευση της ικανότητάς του να λειτουργεί ως πυρήνας σχηματισμού ανθρακικού ασβεστίου. Η επιδιωκόμενη μέθοδος χρειάζεται να μην επηρεάζει σημαντικά το λίθο, να είναι εύκολη και άμεση στην εφαρμογή της, οικονομικά βιώσιμη και ανιχνεύσιμη μετά την ολοκλήρωσή της, ώστε να παρακολουθείται εύκολα η πορεία χρονικά μετά την επέμβαση. Οι μικροοργανισμοί απομονώθηκαν από τα αρχαία σημεία εξόρυξης Πεντελικού μαρμάρου και από το σπήλαιο της Παιανίας, έτσι ώστε να έχουν ήδη προσαρμοστεί στο ολιγότροφο περιβάλλον του λίθου. Από την Πεντέλη η δειγματοληψία πραγματοποιήθηκε χειμώνα μετά από έντονη βροχόπτωση, ώστε να μειωθούν οι μικροοργανισμοί οι οποίοι είχαν πρόσφατα επικαθίσει λόγω πιθανής μεταφοράς τους μέσω του αέρα. Την ίδια εποχή έγινε και η δειγματοληψία στο σπήλαιο της Παιανίας, όπου η ροή υδάτων από την επιφάνεια προς το εσωτερικό του σπηλαίου είχε ενεργοποιήσει τη μικροχλωρίδα. Η επιλογή έγινε για ετερότροφους μικροοργανισμούς οι οποίοι δεν έχουν απαιτητικές θρεπτικές αξιώσεις για την καλλιέργειά τους, ώστε να αρκούνται σε ένα γενικό θρεπτικό μέσο, μειώνοντας έτσι το εκτιμώμενο κόστος της διαδικασίας. Αναπτύχθηκε από την αρχή πλήρως η μεθοδολογία γενετικής ταυτοποίησης για στελέχη απομονωμένα από τα συγκεκριμένα υποστρώματα, διότι οι περισσότερες δημοσιεύσεις στον τομέα, δεν στόχευαν την αλληλούχηση σχεδόν ολόκληρου του 16S rDNA, αλλά ένα μικρό μέρος του. Επομένως, για μια ολοκληρωμένη προσέγγιση, κρίθηκε απαραίτητο να πραγματοποιηθεί ακριβέστερη ταυτοποίηση των μικροοργανισμών, προσέγγιση που να καθιστά την προτεινόμενη μέθοδο αποδεκτή από το σύνολο των ερευνητών. Ακολούθησε η δημιουργία του νέου θρεπτικού διαλύματος. Δοκιμάστηκαν μια σειρά εναλλακτικών συστατικών και επιλέχθηκε ο βέλτιστος συνδυασμός για τη πλειονότητα των απομονωμένων βακτηρίων και ειδικά για αυτά που παρουσίαζαν ταχύτερο σχηματισμό ανθρακικού ασβεστίου σε στερεές καλλιέργειες. Μετά την ταυτοποίηση των μικροοργανισμών και την εξέλιξη των θρεπτικών υγρών, έγινε έλεγχος της καμπύλης ανάπτυξης όλων των βακτηρίων σε υγρές καλλιέργειες, με σκοπό να εξακριβωθεί ο χρόνος στον οποίο το κάθε στέλεχος φτάνει στη μέγιστη πληθυσμιακή του κατάσταση. Ακολούθησαν οι πρώτες δοκιμές για απόθεση ανθρακικού ασβεστίου σε στερεές και υγρές καλλιέργειες, συγκεντρώνοντας σημαντικές πληροφορίες για την πολυμορφικότητα του βιο-υλικού και για το πότε ολοκληρώνεται η διαδικασία, λαμβάνοντας εξαρχής υπόψη ότι η βελτιστοποίηση αφορά και το χρόνο ολοκλήρωσης. Τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις θρεπτικού διαλύματος δοκιμάστηκαν αρχικά και αναλύθηκε διεξοδικά η μορφολογία, το είδος του ανθρακικού ασβεστίου, το χρώμα των κρυστάλλων, καθώς και οι μεταβολές του pH, της κατανάλωσης οξικού ανιόντος και της μείωσης του κατιόντος ασβεστίου σε συνάρτηση με το χρόνο. Με αυτόν τον τρόπο επελέγησαν οι μικροοργανισμοί με τις καλύτερες προϋποθέσεις. Η επιλογή του μαρμάρου ως υπόστρωμα έγινε για τους εξής λόγους: πρώτον αποτελεί ένα υλικό από το οποίο έχουν κατασκευαστεί μνημεία πολιτιστικής κληρονομιάς παγκόσμιου βεληνεκούς, ειδικά στον Ελλαδικό χώρο, δεύτερον δεν έχει δοκιμαστεί διεξοδικά βάσει της υπάρχουσας βιβλιογραφίας για την ικανότητα απόθεσης μικροοργανισμών πάνω σε αυτό και τρίτον θεωρούμε ότι σε σχέση με πιο πορώδεις λίθους αποτελεί τη δυσκολότερη επιφάνεια στην οποία μπορούν να αποθέσουν οι μικροοργανισμοί λόγω των ελάχιστων πόρων που διαθέτει. Οι πόροι μπορούν να προσφέρουν την κατάλληλη θέση ώστε τα βακτήρια να μπορέσουν να έρθουν σε επαφή με το υπόστρωμα, να το εποικήσουν και να αρχίσουν τη διαδικασία σχηματισμού ανθρακικού ασβεστίου. Αυτή τη «φιλοξενία» το Πεντελικό μάρμαρο δεν την προσφέρει. Αντιθέτως τα μόνα σημεία, όπως θα παρουσιαστεί στα αποτελέσματα, είναι τα σημεία θραύσης των κρυστάλλων ανθρακικού ασβεστίου και όπου αλλάζουν διεύθυνση, σχηματίζοντας εσοχές. Από τα προκαταρτικά πειράματα, επιλέχθηκαν τελικά οι δύο αποδοτικότεροι μικροοργανισμοί Cupriavidus metallidurans ACA-DC 4073 και Bacillus pumilus ACA-DC 4061, λαμβάνοντας υπόψη ποσοτικές παραμέτρους, όπως συνολική απόθεση πάνω στο δοκίμιο, βιωσιμότητα του στελέχους, αλλά και ποιοτικές παραμέτρους όπως να μη μεταφέρεται χρώμα από τον μικροοργανισμό στους κρυστάλλους. Με την εφαρμογή στατιστικού σχεδιασμού πειραμάτων βελτιστοποιήθηκε η απόθεση ως προς τρεις παράγοντες: συγκέντρωση θρεπτικού, συγκέντρωση εμβολιασμού κυττάρων και θερμοκρασία. Η διαδικασία έδωσε τη δυνατότητα με μια σειρά ταυτόχρονων πειραμάτων να παρακολουθηθεί υπό ποιες συνθήκες οι μικροοργανισμοί απέδωσαν τη μέγιστη απόθεση. Οι βέλτιστες συνθήκες που εντοπίστηκαν με το σχεδιασμό ελέγχθηκαν σε επιπλέον πείραμα για την εγκυρότητά τους και τα τελικά δείγματα αναλύθηκαν για την αντοχή του αποτεθέντος υλικού με την εφαρμογή υπερήχων. Τέλος, ως ολοκλήρωση της έρευνας, οι μικροοργανισμοί εφαρμόστηκαν σε μεγαλύτερη επιφάνεια μαρμάρου με ψεκασμό, σε μη αποστειρωμένες συνθήκες, ως προκαταρκτική προσομοίωση πραγματικής εφαρμογής των αποτελεσμάτων στο περιβάλλον. Το μόνο που διατηρήθηκε σταθερό ήταν η θερμοκρασία επώασης. Και τα δύο στελέχη απέδωσαν ικανοποιητικά σε υγρές καλλιέργειες υπό τις βέλτιστες συνθήκες αλλά και κατά τον ψεκασμό τους. Όπως θα παρουσιαστεί στα αποτελέσματα, η απόθεση είναι σημαντική στην επιφάνεια του μαρμάρου και παραμένει σχεδόν ανέπαφη με την εφαρμογή των υπερήχων. Σημαντική ανακάλυψη επίσης, αποτελεί η συστηματική απόθεση βατερίτη και όχι ασβεστίτη από το σύνολο των μικροοργανισμών, με τη χρήση του προτεινόμενου θρεπτικού. Ο βατερίτης λόγω της αστάθειάς του θεωρείται ότι μετατρέπεται σχετικά σύντομα σε ασβεστίτη. Η παρέμβαση των μικροοργανισμών στη διαδικασία σχηματισμού, απέδειξε ότι ο βατερίτης παραμένει σταθερός για παρατεταμένο χρονικό διάστημα χωρίς να ανιχνεύεται κάτι διαφορετικό, ακόμα και μετά την εφαρμογή υπερήχων. Είναι μια σημαντική διαφοροποίηση, η οποία βιβλιογραφικά ξεκίνησε να γίνεται αποδεκτή μόλις πρόσφατα. Παλαιότερα, η απόθεση βατερίτη θεωρείτο μειονέκτημα και οι μικροοργανισμοί οι οποίοι σχημάτιζαν αυτή τη δομή, δεν θεωρούνταν ικανοί να αποδώσουν σε διαδικασίες προστασίας μνημείων. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στη διατριβή αποδεικνύουν όμως το αντίθετο. Από τους δύο μικροοργανισμούς που τελικά χρησιμοποιήθηκαν, ο ένας (Cupriavidus metallidurans ACA-DC 4073) δεν έχει απομονωθεί στο παρελθόν από λίθινες επιφάνειες, όπως και ορισμένα από τα υπόλοιπα στελέχη που δοκιμάστηκαν. Επιπλέον ο Bacillus pumilus ACA-DC 4061 έχει αναφερθεί στη βιβλιογραφία, αλλά οι δυνατότητες απόθεσής του δεν είχαν αναλυθεί διεξοδικά. Βάσει των προϋποθέσεων που τέθηκαν στην πρώτη παράγραφο της περίληψης μπορούμε να θεωρήσουμε επιτυχή τα αποτελέσματα, εφόσον η επιδιωκόμενη μέθοδος: • Απαιτείται να μην επηρεάζει σημαντικά το λίθο: η διαδικασία απόθεσης διαφοροποίησε ελάχιστα τη μορφολογία της επιφάνειας ενώ η χρωματική μεταβολή για τα επιλεγμένα στελέχη μπορεί να ελεγχθεί βάσει του χρόνου εφαρμογής της μεθόδου. • Να είναι εύκολη και άμεση στην εφαρμογή της: η προτεινόμενη προσέγγιση χρειάζεται μερικές ημέρες για να είναι το επιλεγμένο στέλεχος έτοιμο προς ψεκασμό, ενώ η χρήση του ψεκασμού καθαυτού, προσφέρει άμεση κάλυψη μεγάλης επιφάνειας. Το θρεπτικό που χρησιμοποιείται μπορεί να παρασκευαστεί εύκολα και δεν χρειάζονται εξειδικευμένα συστατικά. • Να είναι οικονομικά βιώσιμη: το κόστος του μικροοργανισμού είναι μηδαμινό, μιας και απομονώθηκε από το περιβάλλον, ενώ του θρεπτικού είναι περιορισμένο, σε σχέση με τη χρήση κάποιου εξειδικευμένου θρεπτικού, που θα χρειαζόταν ακριβότερα συστατικά. Επιπλέον, ο χρόνος παραγωγής ικανών ποσοτήτων βακτηρίου έτοιμου προς εφαρμογή, δεν θεωρείται ικανός να αυξήσει σημαντικά το κόστος. • Να είναι ανιχνεύσιμη μετά την ολοκλήρωσή της: ο συστηματικός σχηματισμός βατερίτη προσφέρει αυτή τη δυνατότητα διότι η δομή του διαφοροποιείται από τη δομή του ανθρακικού ασβεστίου, αλλά και τυχόν προσμείξεων σε λίθινα υποστρώματα, τόσο του μαρμάρου, όσο και άλλων. Οι εικόνες λεπτών τομών αναδεικνύουν αυτήν τη δυνατότητα, καθώς η νέα απόθεση διαφοροποιείται σημαντικά και είναι ευκρινής στο οπτικό μικροσκόπιο. Επίσης, η ανάλυση με FT-IR, η οποία είναι αμεσότερη, δίνει τη δυνατότητα επιβεβαίωσης της διαφοροποίησης του βατερίτη από τον ασβεστίτη.