Μελέτη της ανάκτησης βιοδραστικών συστατικών από το αρωματικό φυτό satureja thymbra (Θρούμπι) - Παρασκευοπούλου, Κατερίνα (Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, 2016)
Στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η μελέτη των μεθόδων ανάκτησης των βιοδραστικών συστατικών του φυτού S.Thymbra (θρούμπι), που ανήκει στην οικογένεια Lamiaceae, και η προσπάθεια αριστοποίησης των διεργασιών ανάκτησης με βάση την απόδοση σε βιοδραστικά συστατικά. Η εργασία διακρίθηκε σε δύο κύρια στάδια· στο πρώτο στάδιο, μελετήθηκε η διεργασία της παραλαβής του αιθέριου ελαίου με την τεχνική της υδρο-ατμοαπόσταξης. Η διεργασία ολοκληρώθηκε σε 260 min, και η απόδοσή της σε αιθέριο έλαιο ανήλθε σε 4,3 mL/100 g φυτού. Κατά τη διάρκεια της υδρο-ατμοαπόσταξης, γίνονταν τακτικές δειγματοληψίες αιθέριου ελαίου, και μετά από κατάλληλη αραίωση, ακολουθούσε ανάλυση των δειγμάτων με άερια χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας GC-MS, ώστε να μελετηθεί η ανάκτηση των μεμονωμένων συστατικών του αιθερίου ελαίου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το βασικότερο συστατικό του αιθέριου ελαίου είναι η καρβακρόλη, σε ποσοστό 36,47 %, επί των συνολικών συστατικών του ελαίου, με αμέσως επόμενο συστατικό το γ-τερπινένιο, σε ποσοστό 34,51 %. Ως δευτερεύοντα συστατικά χαρακτηρίστηκαν το p-κυμένιο, το trans-καρυοφυλλένιο και το α-τερπινένιο, σε ποσοστά 10,3 %, 7,4 % και 3,4 %, αντίστοιχα. Σχετικά με τις κύριες ουσίες, διαπιστώθηκε πως το γ-τερπινένιο απέσταξε στην αρχή της διεργασίας, και μέχρι τα 20 min είχε παραλειφθεί η μεγαλύτερη ποσότητά του, ενώ στην περίπτωση της καρβακρόλης, η μεγαλύτερη ποσότητά της ανακτήθηκε από τα 50 min έως το τέλος της διεργασίας. Με βάση τα συμπεράσματα αυτά, ακολούθησε η κλασμάτωση του αιθέριου ελαίου, κατά την οποία, κατέστη δυνατή η παραλαβή κλάσματος τερπενίων και καρβακρόλης και κλάσματος υψηλής περιεκτικότητας καρβακρόλης (78 %), που αντιστοιχούσε στο 1/3 του ολικού ελαίου. Ο λόγος γ-τερπινένιο/καρβακρόλη στο συνολικό αιθέριο έλαιο βρέθηκε ίσος με 1:1, ενώ στο δεύτερο κλάσμα ανήλθε σε 1:11. Στο δεύτερο στάδιο, μελετήθηκε η δυνατότητα ανάκτησης των πολυφαινολών από το απελαιωμένο θρούμπι με διάφορες τεχνικές εκχύλισης. Αρχικά, πραγματοποιήθηκαν διαδοχικές εκχυλίσεις Soxhlet σε ξηρά και κονιοποιημένα δείγματα του απεσταγμένου φυτού, χρησιμοποιώντας διαλύτες αυξανόμενης πολικότητας (πετρελαϊκός αιθέρας, ακετόνη, αιθανόλη), ώστε να απομονωθούν τα άπολα, τα λιγότερο πολικά και τα πολικά συστατικά. Με βάση τα αποτελέσματα, μεγαλύτερη απόδοση βρέθηκε κατά την εκχύλιση με διαλύτη αιθανόλη, και ίση με 14,1 % w/w σε ξήρη βάση, ενώ το εκχύλισμα αυτό, εμφάνισε και την υψηλότερη αντιοξειδωτική δράση, με βάση την ικανότητα δέσμευσης της ελεύθερης ρίζας DPPH (τιμή EC50=271 g ξηρού εκχυλίσματος/kg DPPH). Η απόδοση σε ακετόνη ανήλθε σε 3,37 %, με τιμή EC50=286 g ξηρού εκχυλίσματος/kg DPPH. Αντίθετα, ο πετρελαϊκός αιθέρας παρέλαβε μόνο αδρανή (πιθανώς κηρώδη) συστατικά και το εκχύλισμά του έδειξε πολύ μικρή ικανότητα δέσμευσης ελευθέρων ριζών (EC50=3404 g ξηρού εκχυλίσματος/kg DPPH). Τα εκχυλίσματα αυτά, αναλύθηκαν στη συνέχεια ως προς τα φαινολικά συστατικά τους με LC-MS/MS, και τα κύρια από αυτά βρέθηκαν τα οξέα καφεϊκό, ροσμαρινικό, σαλβιανολικό Α, και λιθοσπερμικό, ενώ ταυτοποιήθηκαν και αγλυκόνες φλαβονοειδών, όπως είναι η κερκετίνη, η λουτεολίνη, και η ναρινγενίνη. Τα πειράματα αυτά απέδειξαν πως πέραν του αιθέριου ελαίου, είναι εφικτή η επιπλέον αξιοποίηση του φυτού αυτού, καθώς μπορεί να οδηγήσει σε αποδόσεις ανάκτησης ουσιών έως και 25 %. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν εκχυλίσεις, χρησιμοποιώντας υδατικό διάλυμα ΚΟΗ. Μελετήθηκαν συγκεντρώσεις υδροξειδίου του καλίου (0 έως 5 %), με διάφορους χρόνους εκχύλισης (7 min-140 min). Τα δείγματα εξετάστηκαν ως προς το φαινολικό περιεχόμενό τους, το οποίο υπολογίστηκε με τη μέθοδο Folin-Ciocalteau, και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν σε ισοδύναμα ppm γαλλικού οξέος (GAE). Παρατηρήθηκε πως η αύξηση της συγκέντρωσης ΚΟΗ από 0 σε 1 %, συνέβαλλε σε μεγάλη αύξηση της απόδοσης της διεργασίας, ενώ αντίθετα, η περαιτέρω αύξηση της συγκέντρωσης KOH μέχρι 5 %, οδήγησε σε ελάχιστη ή καθόλου αύξηση της απόδοσης. Στα πλαίσια της αριστοποίησης της εκχύλισης, εφαρμόστηκε αλκαλική εκχύλιση με χρήση υπερήχων και χρησιμοποιήθηκε σχεδιασμός Box-Beckhen, με βάση τον οποίο εξετάστηκαν οι παράμετροι: συγκέντρωση ΚΟΗ, λόγος φυτόμαζας προς μέσο εκχύλισης, και χρόνος εκχύλισης. Η παράμετρος αριστοποίησης ήταν η απόδοση σε πολυφαινόλες, η συγκέντρωση των οποίων προσδιοριζόταν με τη μέθοδο Folin-Ciocalteau. Τα αποτελέσματα επεξεργάστηκαν με το πρόγραμμα STATISTICA, και διαπιστώθηκε πως ο χρόνος αποτελεί τη βασική παράμετρο που επηρεάζει την βελτιστοποίηση της εκχύλισης. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε μια νέα σειρά πειραμάτων, ώστε να μελετηθεί η επίδραση των υπερήχων, του υδροξειδίου του καλίου και του συνδυασμού τους στη σύσταση των εκχυλισμάτων και στην ικανότητα δέσμευσης ελεύθερων ριζών. Πραγματοποιήθηκε εκχύλιση σε αλκαλικό περιβάλλον (0,5 %) με απλή ανάδευση, σε υδατικό περιβάλλον με χρήση υπερήχων, και σε αλκαλικό περιβάλλον (0,5 %) με χρήση υπερήχων. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με δύο διαφορετικές παρτίδες φυτικού υλικού, ίδιας προέλευσης, αλλά διαφορετικού έτους συγκομιδής, ώστε να ελεγχθεί η επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων. Η συγκέντρωση των φαινολών προσδιοριζόταν με τη μέθοδο Folin-Ciocalteau, και διαπιστώθηκε πως οι περισσότερες φαινόλες παραλήφθηκαν κατά την εκχύλιση με υπέρηχους, σε αλκαλικό περιβάλλον, και οι λιγότερες με χρήση υπέρηχων σε υδατικό περιβάλλον. Η αντιοξειδωτική δράση των εκχυλισμάτων, εκφράστηκε με την περάμετρο EC50, με βάση την οποία φάνηκε πως και τα τρία εκχυλίσματα είχαν καλή δράση. Παρ΄όλα αυτά παρουσιάσθηκε μεγάλη διαφορά στις τιμές EC50 των υδατικών εκχυλισμάτων των δύο παρτίδων, η οποία πιθανότατα οφείλεται στη διαφορετική τους σύσταση. Τα εκχυλίσματα αναλύθηκαν με τη μέθοδο HPLC-DAD, και με βάση τα χρωματογραφήματα που προέκυψαν, παρατηρήθηκε πως σε όλες τις περιπτώσεις τα κύρια συστατικά που ταυτοποιήθηκαν ήταν το ροσμαρινκό οξύ, το καφεϊκό οξύ, η λουτεολίνη-7-rutinoside και διάφοροι εστέρες φλαβονοειδών. Ωστόσο, αν και η παρουσία υδροξειδίου του καλίου απουσία υπερήχων, είναι πιθανόν να προκάλεσε χημική μεταβολή του ροσμαρινικού οξέος, μειώνοντας την ποσότητά του και αυξάνοντας την ποσότητα του καφεϊκού, δεν προέκυψαν σαφή συμπεράσματα για το συνδυασμό υδροξειδίου καλίου και υπερήχων. Γενικώς, η περιεκτικότητα του καφεϊκού οξέος στα εκχυλίσματα ενισχύθηκε από την παρουσία υδροξειδίου του καλίου, αντίθετα τα σαλβιανολικά οξέα δεν ανιχνεύθηκαν στις εκχυλίσεις που πραγματοποιήθηκαν σε αλκαλικό περιβάλλον. Σχετικά με την εκχύλιση των φλαβονών, προέκυψαν επίσης αντιφατικά αποτελέσματα από τις δύο διαφορετικές παρτίδες φυτικού υλικού. Επομένως, χρειάζονται επί πλέον πειράματα για να διευκρινιστεί πώς η σύσταση του φυτικού υλικού και οι πειραματικές συνθήκες επηρεάζουν την ανάκτηση των επί μέρους φαινολικών συστατικών και την αντιοξειδωτική δράση του εκχυλίσματος.