Απομόνωση και βιοχημικός χαρακτηρισμός νέας θερμοσταθερής κυτταρινάσης από εμπλουτισμένο μεταγονιδιωματικό δείγμα Ισλανδικής θερμοπηγής - Κίσσας, Δημήτριος (Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας, 2015)
Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο ευρύτερο πλαίσιο του Ευρωπαϊκού ερευνητικού προγράμματος HotZyme (EU/FP7/KBBE-2010.3.5-0) που είχε ως στόχο την ανακάλυψη νέων, θερμοανθεκτικών υδρολασών από θερμά περιβάλλοντα μέσω μεταγoνιδιωματικής ανάλυσης. Κατά τη διάρκεια της εργασίας έγινε απομόνωση και χαρακτηρισμός μια νέας θερμοσταθερής κυτταρινάσης με ενδιαφέρουσες ιδιότητες που την καθιστούν υποψήφιο ένζυμο για βιομηχανική χρήση. Στο πλαίσιο του προγράμματος πραγματοποιήθηκε βιοπληροφορική ανάλυση μεταγονιδιωματικού δείγματος εμπλουτισμένου σε πολυσακχαρίτες. Από τα δεδομένα αυτά, επιλέχθηκε ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης λόγω της σχετικής ομοιότητας (59%) με μια χαρακτηρισμένη ενδογλουκανάση του Bacillus Akibai [1]. Η αλληλουχία αυτή απομονώθηκε με PCR από το μεταγονιδιωματικό δείγμα DNA, εκφράστηκε σε E. coli και βρέθηκε ότι κωδικοποιεί μια GH5 ενδογλουκανάση η οποία και ονομάστηκε CelDZ1a. Με χρήση βιοπληροφορίκων εργαλείων προβλέφθηκε η ύπαρξη μιας διαμεμβρανικής έλικας στο Ν-τελικό άκρο της πρωτεΐνης η οποία και αφαιρέθηκε, δίνοντας την παραλλαγή της αρχικής πρωτεΐνης που αναφέρεται ως CelDZ1. Η αφαίρεση της διαμεμβρανικής έλικας διευκόλυνε τον καθαρισμό και αύξησε τα επίπεδα έκφρασης του ενζύμου, καθώς και την αντίσταση του σε πρωτεόλυση κατά τη διάρκεια παραγωγής του. Τέλος πραγματοποιήθηκε ο βιοχημικός χαρακτηρισμός της CelDZ1 κατά τον οποίο προσδιορίστηκαν τα χαρακτηριστικά του νέου ενζύμου κάτω από ένα μεγάλο εύρος συνθηκών. Η κυτταρινάση CelDZ1 παρουσιάζει βέλτιστη θερμοκρασία λειτουργίας τους 70 oC με χρόνο ημιζωής περίπου 4.5 h στους 70 οC βαθμούς και βέλτιστη τιμή pH 5. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι το νέο ένζυμο παρουσιάζει εξαιρετική σταθερότητα παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων αλάτων, ακόμα και όταν αυτές προσεγγίζουν το σημείο κορεσμού. Επίσης, η δράση του ενισχύεται παρουσία ιόντων μαγγανίου και β-μερκαπτοαιθανόλης ενώ μειώνεται παρουσία ιόντων σιδήρου. Τέλος, ενδιαφέρων παρουσιάζει το γεγονός ότι η CelDZ1 επιδεικνύει εξαιρετική εκλεκτικότητα στην διάσπαση των β-1,4 γλυκοζιτικών δεσμών των διαλυτών υποστρωμάτων.