Βελτιστοποίηση και θερμοδυναμική μελέτη ενζυμικής σύνθεσης εστέρων της τυροσόλης σε υδατικό σύστημα - Νόρρα, Φλοριάν (Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας, 2015)
Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η μελέτη της ενζυμικής μετεστερο-ποίησης της τυροσόλης με διάφορους βινυλεστέρες λιπαρών οξέων διαφορετικών μηκών ανθρακικής αλυσίδας σε υδατικό σύστημα κορεσμένο στον ακυλοδότη. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε βελτιστοποίηση της σύνθεσης του βουτυρικού εστέρα της τυροσόλης και μελέτη της κινητικής της. Επίσης, για την κατανόηση του συστήματος της αντίδρασης, πραγματοποιήθηκαν θερμοδυναμικές μελέτες. Αρχικά, κουτινάση από τον μικροοργανισμό Fusarium oxysporum (FoCut5a) παράχθηκε ετερόλογα σε επιδεκτικά στελέχη E.coli BL21 (DE3). Ο πλασμιδιακός φορέας που χρησι-μοποιήθηκε ήταν ο pET22b(+) ενώ το θρεπτικό υλικό ήταν το LB. Η επαγωγή της έκφρα-σης πραγματοποιήθηκε με την προσθήκη IPTG (0.1 mΜ) και η επώαση πραγματοποιήθη-κε στους 16οC για 20 h. Ο καθαρισμός της παραχθείσας πρωτεΐνης έγινε σε στήλη βαρύ-τητας IMAC με ρητίνη ακινητοποιημένων ιόντων κοβαλτίου Talon® Metal Affinity Resin. Το μοριακό βάρος της προσδιορίστηκε στα 23 kDa ενώ το ισοηλεκτρικό της σημείο στα 7.9. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε μελέτη της εκλεκτικότητας του ενζύμου με τη χρήση διαφορετικών βινυλεστέρων ως ακυλοδότες, του οξικού, προπιονικού, βουτυρικού, δεκα-νοϊκού, λαυρικού που διέφεραν στο μήκος της ανθρακικής τους αλυσίδας. Οι μεγαλύτε-ρες αποδόσεις προέκυψαν για το βουτυρικό και τον προπιονικό βινυλεστέρα (40 και 43% αντίστοιχα) με τον οξικό (30%) να ακολουθεί. Οι αποδόσεις για το δεκανοϊκό και το λαυ-ρικό βινυλεστέρα ήταν πολύ μικρές (της τάξης του 1%) Για τη βελτιστοποίηση της αντίδρασης μετεστεροποίησης της τυροσόλης με τον βουτυρι-κό βινυλεστέρα, εξετάστηκαν το pH, η θερμοκρασία, η συγκέντρωση του ενζύμου και η συγκέντρωση της τυροσόλης. Το βέλτιστο pH ήταν 7, η βέλτιστη θερμοκρασία 20 oC, βέλ-τιστη συγκέντρωση ενζύμου τα 5 μg/mL και βέλτιστη συγκέντρωση τυροσόλης 12.5 mM. Η αντίδραση βρέθηκε να ακολουθεί κινητική Michaelis-Menten με Km=119.2 mM, kcat=134.6 s-1 και kcat/Km=1129.2 M-1•s-1. Για τις βέλτιστες συνθήκες, η απόδοση ήταν της τάξης του 50%. Η ταυτοποίηση του προϊόντος έγινε με NMR, αφού έγινε παραγωγή του σε μεγάλη κλίμακα και απομονώθηκε με χρωματογραφία προσρόφησης με χρήση silica gel. Η θερμοδυναμική μελέτη έγινε με τη χρήση των μοντέλων UNIFAC και COSMO-RS. Για τους πέντε βινυλεστέρες, υπολογίστηκε η διαλυτότητά τους στο νερό καθώς και η διαλυ-τότητα του νερού σε αυτούς με χρήση του COSMO-RS. Επίσης, για κάθε σύστημα αντί-δρασης, υπολογίστηκαν οι διαλυτότητες των εστέρων της τυροσόλης στο νερό και στους βινυλεστέρες. Τέλος, έγινε και υπολογισμός της κατανομής των προϊόντων κάθε συστή-ματος αντίδρασης στις δύο φάσεις τόσο με το COSMO-RS όσο και με τη UNIFAC. Τα απο-τελέσματα έδειξαν ότι η διαλυτότητα των εστέρων της τυροσόλης είναι πολύ μεγαλύτερη στην οργανική φάση από αυτήν στην υδατική και ότι το μεγαλύτερο μέρος του προϊόντος που παράγεται στην αντίδραση κατανέμεται στην οργανική φάση. Τα παραπάνω αποτε-λέσματα μας οδηγούν στον συμπέρασμα ότι πιθανότητα η αντίδραση πραγματοποιείται στην υδατική φάση (ή στην διεπιφάνεια) που έχει πρόσβαση το ένζυμο και το προϊόν με-τά την παραγωγή του μεταφέρεται στην οργανική φάση όπου και «προστατεύεται» από την υδρόλυση. Αυτή η ερμηνεία μπορεί να δικαιολογήσει και τις πολύ μικρές αποδόσεις των δύο εστέρων μεγάλων ανθρακικής αλυσίδας, καθώς δεν έχουν πρόσβαση στο νερό, λόγω αμελητέας διαλυτότητας σε αυτό. Αυτή είναι η πρώτη φορά που αναφέρεται ενζυμική σύνθεση του βουτυρικού εστέρα της τυροσόλης ενώ δεν έχει επίσης αναφερθεί στο παρελθόν κουτινάση σε ελεύθερη μορφή να καταλύει αντίδραση «αντίστροφης υδρόλυσης» σε υδατικό σύστημα κορεσμένο στον ακυλοδότη.