MtMan26a: Η έκφραση μιας GH26 μαννανάσης από τον Myceliophthora thermophila και ο ρόλος της στην αποδόμηση της λιγνινοκυτταρινούχας βιομάζας - Πετρόπουλος, Περικλής (Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας, 2015)
Στην παρούσα διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε υπερέκφραση και απομόνωση μιας μαννανάσης του ασκομύκητα Myceliophtora thermophila (NCBI Gene ID: 11508627), ο βιοχημικός χαρακτηρισμός της και η συνεργιστική της δράση με εμπορικά κυτταρινολυτικά ένζυμα σε προκατεργασμένο φυσικό υπόστρωμα Lignocel. Η έκφραση πραγματοποιήθηκε με συνθετικό, codon-optimized, γονίδιο, το οποίο προσαρτήθηκε σε πλασμίδιο pPICZαC, αυξήθηκε και μετασχηματίστηκε σε ζύμη Pichia pastoris (στέλεχος Χ33). Ακολούθησε καλλιέργεια των μετασχηματισμένων στελεχών για παραγωγή μεγαλύτερης ποσότητας της μαννανάσης. Η μαννανάση απομονώθηκε από την καλλιέργεια με χρήση στήλης συγγένειας ιόντων κοβαλτίου. Η αποτελεσματικότητα του καθαρισμού ελέγχθηκε με ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) όπου επιβεβαιώθηκε η παρουσία μόνο της επιθυμητής πρωτεΐνης και το μοριακό βάρος της παραγόμενης πρωτεΐνης προσδιορίστηκε στα 60 kDa. Στην συνέχεια πραγματοποιήθηκε μελέτη της δράσης της μαννανάσης πάνω σε υπόστρωμα γαλακτομαννάνης χαρουπιού (συγκέντρωσης 0.5%) σε διαφορετικές συνθήκες pH και θερμοκρασίας, καθώς και η σταθερότητα της σε περιβάλλοντα διαφορετικών pH και θερμοκρασιών. Αποδείχθηκε ότι η μέγιστη δραστικότητα της εμφανίζεται σε pH 6 και θερμοκρασία 60 °C, ενώ είναι αρκετά σταθερή σε ένα εύρος pH 4-11 (βέλτιστη σταθερότητα pH 8). Επίσης, παρουσιάζει μεγάλη θερμοκρασιακή σταθερότητα (>95% στις 24 h) για θερμοκρασίες κάτω των 40 °C, αρκετά καλή θερμοκρασιακή σταθερότητα σε θερμοκρασία 50 °C (>85% στις 24h). Η ενεργότητα του ενζύμου μειώνεται σημαντικά για θερμοκρασίες άνω των 60 °C (χρόνος ημιζωής 5 h στους 60 °C, 1 h στους 65 °C). Εξετάστηκε η κινητική της ενζυμικής δράσης σε εύρος συγκεντρώσεων του υποστρώματος. Ακόμη, ερευνήθηκε η δράση του ενζύμου σε διαφορετικά υποστρώματα που απαντώνται στην λιγνινοκυτταρινούχο βιομάζα με το ένζυμο να εμφανίζει ισάξια ενεργότητα σε υπόστρωμα γλυκομαννάνης, ενώ δεν παρατηρήθηκε ενεργότητα σε υποστρώματα β-γλουκάνης και ξυλάνης σημύδας. Η δέσμευση του ενζύμου από κρυσταλλική κυτταρίνη μετρήθηκε και ανευρέθηκε ότι είναι μηδαμινή. Η μελέτη της συνεργιστικής δράσης του ενζύμου μαζί με εμπορικά κυτταρινολυτικά ένζυμα έδειξε βελτίωση (~10%) στην απελευθέρωση σακχάρων από υπόστρωμα προκατεργασμένου Lignocel.