Χαρακτηρισμός μιας ανασυνδυασμένης β-γλυκοσιδάσης της οικογένειας GH3 από το θερμόφιλο οργανισμό Myceliopthora thermophila - Δημητρακοπούλου, Ελένη- Αλκμήνη (Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV), 2013)
Η κυτταρίνη αποτελεί το οργανικό πολυμερές που βρίσκεται σε μεγαλύτερη αφθονία στη φύση, γεγονός που την καθιστά κατάλληλη ως φτηνά αξιοποιήσιμη, ανανεώσιμη πηγή ,κατάλληλη για μεγάλο αριθμό βιοτεχνολογικών εφαρμογών. Συνεπώς, η παραγωγή και απομόνωση νέων κυτταρινολυτικών ενζύμων που αποικοδομούν ή τροποποιούν τα λιγνινοκυτταρινούχα υλικά αποτελεί επιτακτική ανάγκη. Βασικό ρόλο ανάμεσα στις κυτταρινάσες διαδραματίζουν οι β-γλυκοζιδάσες, οι οποίες υδρολύουν την κελλοβιόζη που έχει παραχθεί προς γλυκόζη. Η δράση αυτή των β-γλυκοζιδασών είναι πολύ σημαντική καθώς αποφεύγεται η αναστολή της δράσης των κυτταρινασών από το τελικό προϊόν. Σημαντική πηγή κυτταρινολυτικών ενζύμων με πολλές βιοτεχνολογικές εφαρμογές, αποτελούν οι θερμόφιλοι μύκητες, καθώς οι διεργασίες μετατροπής της βιομάζας σε χρήσιμα προϊόντα διεξάγονται σε υψηλές θερμοκρασίες. Ο Mycelipthora thermophila είναι ένας θερμόφιλος αερόβιος μύκητας, ο οποίος αυξάνεται με μέγιστο ρυθμό σε θερμοκρασίες 45 – 50 οC και παράγει πολλά θερμοσταθερά ένζυμα, κατάλληλα για βιοδιεργασίες υψηλών θερμοκρασιών. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν ο έλεγχος των ιδιοτήτων μιας πρωτεΐνης με ενεργότητα β-γλυκοζιδάσης, της οποίας το γονίδιο είχε προηγουμένως απομονωθεί από το μύκητα Mycelipthora thermophila και στη συνέχεια εκφραστεί ετερόλογα στο ζυμομύκητα Pichia pastoris. Η ανασυνδυασμένη β-γλυκοζιδάση ΜtBgI3a παρουσιάζει μοριακό βάρος 90 kDa και ειδική ενεργότητα στο υπόστρωμα p-NP-β-D-γλυκοπυρανοζίτη ίση με 97.7 U/mg πρωτεΐνης. Το ανασυνδυασμένο ένζυμο ΜtBgI3a είναι μια πρωτεΐνη με κυρίαρχη ενεργότητα β-γλυκοζιδάσης, η οποία μπορεί και να υδρολύει σε μικρότερα ποσοστά υποστρώματα γλουκανών, ενώ με βάση την εξειδίκευση που παρουσιάζει στα διάφορα υποστρώματα μπορεί θεωρείται ότι ανήκει στην κατηγορία των αρυλ-β-γλυκοζιδασών. Οι δοκιμές σταθερότητας σε διάφορες θερμοκρασίες κατέδειξαν μετά από επώαση 60 λεπτών διατηρεί περίπου το 56.3% της ενεργότητάς του σε θερμοκρασία 60οC, άρα μπορεί να θεωρηθεί θερμοσταθερό. Πλεονέκτημα αποτελεί, επίσης η διατήρηση περίπου του 95% της ενεργότητας του ενζύμου σε θερμοκρασία 30 και 40οC, καθώς κρίνεται απαραίτητη η σταθερότητα σε θερμοκρασία δωματίου. Ακόμα, παρουσιάστηκε μικρή αναστολή της δράσης του ενζύμου από τα μέταλλα Ca2+, Co2+, EDTA , Urea και SDS και ενεργοποίηση του ενζύμου από τα ιόντα Mn2+, Mg2+, Zn2+ και Cu2+. Επίσης, μελετήθηκε η αναστολή του ενζύμου από την D-γλυκόζη, η οποία βρέθηκε ότι αποτελεί ισχυρό αναστολέα της ανασυνδυασμένης β-γλυκοζιδάσης (Κi=282 μM), ενώ η D-ξυλόζη και το D-γλουκονικό οξύ παρουσιάζουν αρκετά μικρότερες σταθερές αναστολής (30μ Μ και 22μ Μ, αντίστοιχα). Η ιδιότητα αυτή της β-γλυκοζιδάσης είναι αρκετά σημαντική, καθώς η αναστολή από τη γλυκόζη παίζει αρνητικό ρόλο στην ενζυμική υδρόλυση της κυτταρίνης στην βιομηχανική παραγωγή. Τέλος, μελετήθηκε η ενεργότητα της β-γλυκοζιδάσης σε αντιδράσεις τρανσγλυκοζυλίωσης και η ανάλυση των προϊόντων έδειξε απότομη αύξηση της σύνθεσης μέθυλο-D-γλυκοζιδών για συγκεντρώσεις κελλοβιόζης από 4% w/v και άνω, ενώ η τιμή της σταθεράς (Km) της αντίδρασης υπολογίστηκε 91mM. Η αντίδραση αυτή είναι αρκετά σημαντική, καθώς η διεξαγωγή της σε βιομηχανικές διεργασίες μειώνει την τελική συγκέντρωση του επιθυμητού προϊόντος, όμως μπορεί να παράξει χρήσιμους ολιγοσακχαρίτες.