ΜΕΛΕΤΗ ΒΙΟΧΗΜΙΚΩΝ, ΚΑΤΑΛΥΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΔΟΜΙΚΩΝ ΜΕΤΑΒΟΛΩΝ ΦΥΤΙΚΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ ΣΕ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΥΠΕΡΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ - Αλεξανδράκης, Ζαχαρίας (Σχολή Χημικών Μηχανικών, 2015)
Αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της επίδρασης τριών παραμέτρων, της πίεσης, της θερμοκρασίας και του χρόνου επεξεργασίας στα βιοχημικά, καταλυτικά και δομικά χαρακτηριστικά ενζύμων, που προέρχονται από φυτικές πηγές, όπως οι πηκτινομεθυλεστεράσες και οι κυστεϊνικές πρωτεϊνάσες. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν οδήγησαν στη γνώση των αιτιών αδρανοποίησης των μελετούμενων ενζύμων σε συγκεκριμένες συνθήκες, καθώς και των μεταβολών που μπορεί να προκληθεί στη δομή τους εξαιτίας της υποβολής τους στις συνθήκες αυτές. Η καλύτερη κατανόηση της συμπεριφοράς των φυτικών ενζύμων σε υψηλές πιέσεις θα μπορούσε να συνεισφέρει πολύτιμη γνώση σε βασικές επιστήμες στο πεδίο της βιολογίας όπως τη βιοχημεία, τη φυσικοχημεία και τη πρωτεϊνική μηχανική, ενώ επιπλέον θα μπορούσε να αποτελέσει το απαραίτητο γνωστικό υπόβαθρο για τη θεμελίωση και βελτιστοποίηση νέων διεργασιών στη βιοχημική μηχανική και στη μηχανική των τροφίμων. Μελετήθηκε η επίδραση της διεργασίας της ΥΠ στη μεταβολή της δραστικότητας φυτικών ενζύμων όπως της πηκτινομεθυλεστεράσης (ΠΜΕ) προερχόμενη από διάφορα φρούτα και των κυστεϊνικών πρωτεϊνασών όπως η παπαΐνη, η φικίνη και η ακτινιδίνη, από φυτικές πηγές. Για όλες τις περιπτώσεις βρέθηκε ότι ο ρυθμός απενεργοποίησης των μελετούμενων ενζύμων ακολουθεί κινητική πρώτης τάξης. Μαθηματικές εξισώσεις έχοντας ως μεταβλητές την πίεση και τη θερμοκρασία χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης των ενζύμων σε ένα μεγάλο εύρος πιέσεων και θερμοκρασιών. Με τη συγκριτική μελέτη που προηγήθηκε συμπεραίνεται ότι τόσο οι ΠΜΕ προερχόμενες από διαφορετική πηγή προέλευσης όσο και οι κυστεϊνικές πρωτεάσες παρουσιάζουν διαφορετική συμπεριφορά στην επεξεργασία την οποία υφίστανται. Πιθανή αιτία που θα μπορούσε να εξηγήσει αυτή την ιδιαίτερη συμπεριφορά των συγκεκριμένων ενζύμων είναι οι μεταβολές στη δομή τους που αποδείχτηκε να προκαλούνται κατά την επεξεργασία τους με ΥΠ. Για αυτό το λόγο μετά τη μελέτη της επίδρασης της συνδυασμένης εφαρμογής της ΥΠ και της θερμοκρασίας στη δραστικότητά τους ακολούθησε η απομόνωση και ο καθαρισμός ΠΜΕ από διαφορετικές ποικιλίες πορτοκαλιών και της ακτινιδίνης από χυμό ακτινιδίου για τον έλεγχο πιθανών μόνιμων αλλαγών της δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής τους μετά από επεξεργασία με ΥΠ. Η επιλογή των συγκεκριμένων ενζύμων έγινε, ώστε να είναι δυνατή η σύγκριση των μηχανισμών απενεργοποίησης εξαιτίας της ΥΠ τόσο παρόμοιων ενζύμων που παρουσιάζουν διαφορετική κινητική συμπεριφορά (μία ανθεκτική ισομορφή ΠΜΕ από φλοιό πορτοκαλιού Navel και μία ευαίσθητη ισομορφή ΠΜΕ από φλοιό πορτοκαλιού ποικιλίας Valencia στην πίεση και στη θερμοκρασία) όσο και ενζύμων από διαφορετικές κατηγορίες (ΠΜΕ και κυστεϊνικές πρωτεάσες). Η απομόνωση (isolation) και ο καθαρισμός (purification) των μελετούμενων ενζύμων πραγματοποιήθηκε με χρήση χρωματογραφίας ιοντανταλλαγής, συγγένειας και μοριακής διήθησης. Ακολούθησε κινητική μελέτη της επίδρασης της ΥΠ στη δραστικότητα των καθαρών ενζύμων, καθώς και μελέτη των δομικών μεταβολών τους μετά από επεξεργασία με ΥΠ με τη χρήση της φασματοσκοπίας κυκλικού διχρωισμού (CD). Οι καθαρές ΠΜΕ προσδιορίστηκαν ως πρωτεΐνες με μέση σχετική μοριακή μάζα 34 και 35 kDa για την ΠΜΕ Valencia και Navel, αντίστοιχα και ισοηλεκτρικό σημείο pI > 9.0. Η ακτινιδίνη προσδιορίστηκε και αυτή ως μία μονομερής πρωτεΐνη με σχετική μοριακή μάζα 24 kDa και ισοηλεκτρικό σημείο pI 3.5. Τα φάσματα CD στο άπω υπεριώδες για τη φυσιολογική διαμόρφωση των ΠΜΕ από πορτοκάλια Navel και Valencia αποκαλύπτουν θετική ελλειπτικότητα σε μήκος κύματος 196nm και αρνητική ελλειπτικότητα στα 216nm. Τα στοιχεία αυτά είναι χαρακτηριστικά της δομής β-πτυχωτού φύλλου. Εξετάστηκαν οι δομικές μεταβολές των ΠΜΕ μετά από επεξεργασία με ΥΠ και θερμική επεξεργασία με τη φασματοσκοπία CD στην άπω υπεριώδη περιοχή 190–260 nm καθώς και στην εγγύς υπεριώδη περιοχή (260–360 nm). Η μετουσιωμένη ΠΜΕ όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης έρευνας διατηρεί τη δευτεροταγή δομή της ανέπαφη, αλλά παρουσιάζει «χαλαρότερη» 3D δομή (απώλεια μεγαλύτερου μέρους της τριτοταγούς δομής), απ’ ότι στη φυσική της κατάσταση. Γενικά, αυτή η μετουσιωμένη μορφή λόγω της πίεσης αποτελεί σημαντικό ενδιάμεσο στο μονοπάτι της αναδίπλωσης και περιγράφεται ως κατάσταση της εύπλαστης σφαίρας (molten globule state). Μπορεί να υποτεθεί ότι η μετουσίωση λόγω της πίεσης που προκαλείται στη δομή των ενζύμων είναι αποτέλεσμα των μεταβολών που συμβαίνουν στην τριτοταγή δομή. Το μέγεθος αυτών των δομικών μεταβολών είναι μεγαλύτερο κατά την εφαρμογή μεγαλύτερων πιέσεων και είναι ανεξάρτητο από το χρόνο επεξεργασίας για θερμοκρασίες περίπου 40οC (πολύ κάτω από τα όρια θερμικής μετουσίωσης της ΠΜΕ). Οι μεταβολές αυτές έχουν επακόλουθη επίπτωση στη σύνδεση υποστρώματος-ενζύμου, οδηγώντας τελικά σε μείωση της δραστικότητάς του. Σχετικά με την ακτινιδίνη (Hayward cv., Actinidia chinensis), τα φάσματα CD στο άπω υπεριώδες για τη φυσιολογική διαμόρφωσή της αποκαλύπτουν θετική ελλειπτικότητα σε μήκος κύματος 192nm και δύο μέγιστα αρνητικής ελλειπτικότητας στα 208 και 222nm. Ανάλυση των φασμάτων στο άπω υπεριώδες χρησιμοποιώντας το λογισμικό CDNN αποκάλυψαν ότι το 38.1 % της δευτεροταγούς δομής της ακτινιδίνης αποτελείται από δομή α-έλικας, ενώ το 23.4 % από β-πτυχωτά φύλλα και β-στροφές. Διαπιστώθηκαν σχεδόν πλήρως αντιστρεπτές μεταβολές της δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής της ακτινιδίνης μετά από εφαρμογή της ΥΠ (500, 750 και 900 ΜPa) στους 60οC για 20 min. Η τριτοταγής δομή της ακτινιδίνης παρέμεινε σταθερή ακόμη και σε πίεση 900 MPa λόγω του υψηλού αριθμού των δισουλφιδικών δεσμών που υπάρχουν στο συγκεκριμένο μόριο. Παρόλα αυτά, παρατηρήθηκε ότι η ακτινιδίνη χάνει τη λειτουργικότητά της με αύξηση της πίεσης. Η εναπομένουσα δραστικότητα ακτινιδίνης μετά από επεξεργασία στα 500, 750 και 900 ΜPa (60oC, 20 min) υπολογίστηκε ίση με επί 80, 62 και 45 % επί της αρχικής, αντίστοιχα. Λαμβάνοντας υπόψη όλα τα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας όσον αφορά την επίδραση της πίεσης στη δευτεροταγή και τριτοταγή δομή της ακτινιδίνης, προτείνεται ότι η μείωση της δραστικότητας του ενζύμου δεν είναι αποτέλεσμα της μετουσίωσης των στοιχείων της δομής της πρωτεΐνης, αλλά ενδεχομένως να σχετίζεται με τη μεταβολή της διάταξης των ομάδων στο ενεργό κέντρο. Στην περίπτωση που το ένζυμο θεωρείται ενεργό, το ανιόν της θειολικής ομάδας είναι συνδεδεμένο με το θετικά φορτισμένο άζωτο της ομάδας ιμιδαζολίου που υπάρχει στο ενεργό κέντρο του ενζύμου. Με εφαρμογή πίεσης ενδεχομένως συμβαίνουν μικρές μεταβολές στο περιβάλλον του ενεργού κέντρου και πιθανόν αυτό το ζεύγος ιόντων να σπάει και οι ελεύθερες φορτισμένες ομάδες (S- και N+) να ενυδατώνονται με ταυτόχρονη μείωση του όγκου του ενζυμικού διαλύματος. Τα παραπάνω οδήγησαν στην απενεργοποίηση του ενζύμου. Συνεπώς, η εφαρμογή της ΥΠ στη δομή των δύο διαφορετικών κατηγοριών ενζύμων που μελετήθηκαν (πηκτινομεθυλεστεράσες και κυστεϊνικές πρωτεάσες) στην παρούσα διδακτορική διατριβή οδήγησε σε διαφορετικούς μηχανισμούς αδρανοποίησης των συγκεκριμένων ενζύμων. Στη συνέχεια, η τεχνολογία της ΥΠ εφαρμόστηκε για την παραγωγή σε πιλοτική κλίμακα φυσικού και αποπικραμένου πορτοκαλοχυμού NFC ποικιλίας Navel. Οι βέλτιστες συνθήκες για την αποτελεσματική (ψυχρή) παστερίωση των συγκεκριμένων χυμών επιλέχτηκαν με βάση την κατά 90% απενεργοποίηση της ΠΜΕ, τη διατήρηση της αντιοξειδωτικής δράσης τους και τη μέγιστη μείωση των αλλοιογόνων μικροοργανισμών. Αξιολογώντας τα αποτελέσματα για κάθε δείκτη ποιότητας, οι προτεινόμενες συνθήκες για την ψυχρή παστερίωση του πορτοκαλοχυμού (Navel) με ΥΠ είναι 600 MPa, 40oC για 3 min. Ακολούθησε συγκριτική μελέτη της επίδρασης της ΥΠ και της συμβατικής θερμικής παστερίωσης στα ποιοτικά και διατροφικά χαρακτηριστικά φυσικού και αποπικραμένου (Navel, ελληνικής προέλευσης) πορτοκαλοχυμού. Πραγματοποιήθηκε συλλογή κινητικών δεδομένων για τους πιο σημαντικούς ποιοτικούς δείκτες των χυμών (περιεκτικότητα σε ασκορβικό οξύ, συνολική αντιοξειδωτική δράση, δραστικότητα της ΠΜΕ, μικροβιολογική ανάλυση, οργανοληπτικά χαρακτηριστικά) τόσο αμέσως μετά την επεξεργασία, όσο και κατά τη διάρκεια της μετέπειτα συντήρησης των χυμών σε διάφορες ισοθερμοκρασιακές συνθήκες (0-15°C). Κατά την αποθήκευση των επεξεργασμένων χυμών στις διάφορες θερμοκρασίες συντήρησης, χαμηλότεροι ρυθμοί απώλειας του ασκορβικού οξέος παρατηρήθηκαν για τους επεξεργασμένους με ΥΠ πορτοκαλοχυμούς, οδηγώντας έτσι σε αύξηση της διατηρησιμότητάς τους σε σύγκριση με τους συμβατικά παστεριωμένους. Ο μικρότερος ρυθμός απώλειας του ασκορβικού οξέος των επεξεργασμένων χυμών με ΥΠ συγκριτικά με τον αντίστοιχο των θερμικά παστεριωμένων δειγμάτων μπορεί να οφείλεται στη διαφορετική μοριακή αναλογία μεταξύ του ασκορβικού οξέος και της αρχικής περιεκτικότητας του οξυγόνου. Συγκεκριμένα, με την πίεση γίνεται υγροποίηση του εγκλωβισμένου αέρα/οξυγόνου μέσα στους πόρους του τροφίμου. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα μετά την αποσυμπίεση να μην υπάρχει διαθέσιμο οξυγόνο εντός του τροφίμου (μη αντιστρεπτή μεταβολή) που να μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την οξείδωση του ασκορβικού οξέος. Επομένως η διάσπαση του ασκορβικού οξέος στα επεξεργασμένα με ΥΠ δείγματα γίνεται υπό αναερόβιες συνθήκες που οι ρυθμοί είναι πολύ μικρότεροι. Όσον αφορά τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των χυμών, τόσο αμέσως μετά την επεξεργασία όσο και κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης, η ΥΠ οδήγησε σε καλύτερη διατήρηση της γεύσης και του αρώματος των μη επεξεργασμένων χυμών πορτοκαλιού συγκριτικά με τη θερμική παστερίωση. Από τα αποτελέσματα προκύπτει ότι οι θερμικά παστεριωμένοι χυμοί κρίνονται μη αποδεκτοί συνολικά με βάση την απώλεια του ασκορβικού οξέος, ενώ αντιθέτως η διατηρησιμότητα των επεξεργασμένων με ΥΠ χυμών κρίνεται βάσει της οργανοληπτικής αξιολόγησης. Όσον αφορά τους αποπικραμένους χυμούς πορτοκαλιού (τόσο μετά από επεξεργασία με ΥΠ όσο και μετά από θερμική παστερίωση) συγκέντρωσαν μεγαλύτερες βαθμολογίες από τους δοκιμαστές ως προς τη γεύση τους, αλλά τα δείγματα δεν θύμιζαν φυσικό πορτοκαλοχυμό. Λαμβάνοντας υπόψη τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης έρευνας, η ΥΠ μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παστερίωση και άλλων χυμών, όπως είναι ο χυμός ιπποφαούς, στους οποίους η εφαρμογή της θερμικής επεξεργασίας οδηγεί σε υποβάθμιση της ποιότητάς τους. Τέλος, η ΥΠ εφαρμόστηκε για την παραγωγή νέων γαλακτοκομικών προϊόντων με εφαρμογή πρωτεολυτικών ενζύμων (ως παράγοντες πήξης του γάλακτος). Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν πέντε διαφορετικά πρωτεολυτικά ένζυμα και προσδιορίστηκε αυτό το οποίο δίνει τις καλύτερες ιδιότητες στο τελικό προϊόν με βάση την οργανοληπτική αποδοχή των προϊόντων, τη σταθερότητά του σε συνθήκες επεξεργασίας και τον ελάχιστο απαιτούμενο χρόνο πήξης. Για την παρασκευή του γαλακτοκομικού προϊόντος, μελετήθηκαν κρίσιμες παράμετροι για την ποιότητά του, όπως τα ολικά στερεά του γάλακτος που θα χρησιμοποιούνταν για την πήξη, η τιμή pH του, η θερμοκρασία και ο απαιτούμενος χρόνος για την πήξη των προϊόντων, καθώς και η προστιθέμενη ποσότητα ενζύμου. Αξιολογώντας τα αποτελέσματα που προέκυψαν, η ακτινιδίνη ήταν το ένζυμο που παρουσίασε τις καλύτερες ιδιότητες και χρησιμοποιήθηκε ως παράγοντας πήξης για την παραγωγή νέων γαλακτοκομικών προϊόντων σε εργαστηριακή κλίμακα. Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε ΥΠ για την επεξεργασία των έτοιμων γαλακτοκομικών προϊόντων που στόχο είχαν τη ρύθμιση της πρωτεολυτικής δραστικότητας του ενζύμου που είχε εμβολιαστεί στα προϊόντα. Η απενεργοποίησή του ήταν απαραίτητη, ώστε να μην υποβαθμιστεί η δομή των προϊόντων από τη συνεχιζόμενη πρωτεόλυση που επιπλέον θα οδηγούσε σε πικρά πεπτίδια στα τελικά προϊόντα. Σε θερμοκρασίες ψύξης το νέο γαλακτοκομικό προϊόν θα μπορούσε να διατηρηθεί ακόμα και για έξι μήνες χωρίς σημαντική υποβάθμιση της ποιότητάς του. Η συγκεκριμένη διατριβή αποτελεί συνδυασμό βασικής και εφαρμοσμένης έρευνας. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν θα αποτελέσουν σημαντική πηγή για την επιστημονική κοινότητα, αφού τεκμηριώνουν την αιτία της μεταβολής της δραστικότητας των σημαντικών αυτών ενζυμικών συστημάτων, όταν αυτά υποβάλλονται σε διαφορετικούς συνδυασμούς ΥΠ και θερμοκρασίας, μέσω της μελέτης της δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής τους καθώς και της θερμοδυναμικής τους σταθερότητας. Επιπλέον, η μελέτη της δραστικότητας επεξεργασμένων με ΥΠ πηκτινολυτικών και πρωτεολυτικών ενζύμων συντελεί στην παραγωγή χυμών φρούτων και λαχανικών με βελτιωμένα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, καθώς και σε γαλακτοκομικά προϊόντα στα οποία τα πρωτεολυτικά ένζυμα θα είναι οι παράγοντες πήξης.